Summary
Lensfree البصرية التصوير المقطعي هو تقنية المجهر ثلاثي الأبعاد الذي يوفر القرار المكانية من ميكرون 1 <× <× 1 ميكرومتر <3 ميكرومتر في سين وصاد وأبعاد Z، على التوالي، أكثر من حجم التصوير كبيرة من 15-100 مم
Abstract
وكان تصوير الشعاعي الطبقي التصوير أداة تستخدم على نطاق واسع في الطب لأنها يمكن أن توفر ثلاثية الأبعاد (3D) معلومات حول هيكلية الكائنات من جداول مختلفة الحجم. في موازين ميكرومتر والمليمتر، وطرائق المجهر الضوئي تجد الاستخدام المتزايد بسبب الطبيعة غير المؤينة من الضوء المرئي، وتوفر مجموعة غنية من مصادر الإضاءة (مثل أشعة الليزر والاضاءة الثنائيات-) وعناصر الكشف (مثل كبير CCD شكل وصفائف كاشف CMOS). بين البلدان المتقدمة مؤخرا البصرية طرائق تصوير الشعاعي الطبقي المجهري، يمكن للمرء أن تشمل التصوير المقطعي التماسك البصري، البصرية التصوير المقطعي الحيود، والبصرية، والتصوير المقطعي إسقاط المجهر الضوئي ورقة. 1-6 توفير هذه المنصات التصوير المقطعية من الكائنات الدقيقة، والخلايا والحيوانات مثل نموذج C. ايليجانس، الزرد وأجنة الفئران.
القائمة التصوير الضوئي 3D عموما أبنية ضخمة ومعقدة نسبيا، والحد من اله توافر هذه المعدات في المختبرات المتقدمة، والتي تعوق اندماجها مع المختبر على واحد في رقاقة المنابر ورقائق ميكروفلويديك. لتوفير بديل مجهر تصوير الشعاعي الطبقي، ونحن وضعت مؤخرا lensfree البصرية التصوير المقطعي (الكثير) كطريقة التصوير المقطعي البصرية عالية الإنتاجية، والتعاقد وفعالة من حيث التكلفة. المرتجع LOT (7) واستخدام العدسات والمكونات البصرية الضخمة، وتعتمد بدلا من ذلك على زاوية متعددة الإضاءة والحساب الرقمي لتحقيق معمق حل تصوير الكائنات الدقيقة على مدى حجم التصوير كبير. يمكن LOT عينة صورة البيولوجية في القرار المكانية من ميكرون 1 <س <1 ميكرومتر X <3 ميكرومتر في سين وصاد وأبعاد Z، على التوالي، أكثر من حجم التصوير كبيرة من 15-100 ملم 3، ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص لل المختبر على واحد في رقاقة المنصات.
Protocol
1. التصوير الإعداد
يمكن تجميعها الكثير في مجال الهندسة المعمارية المحمولة مدمجة وخفيفة الوزن 8، وبدلا من ذلك كما مجهر optofluidic مع قدرة التصوير المقطعية. (9) وفي هذا التقرير، إلا أننا سوف يصف الإعداد التصوير الأساسية لتنفيذ مقاعد البدلاء أعلى نحو ثابت من التصوير المقطعي عينات.
- وحدة إضاءة: في الكثير، ويمكن استخدام مصادر الضوء متماسك جزئيا مثل الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح). المرونة التجريبية، استخدمنا مستوحد اللون مع مصباح زينون (حجر الزاوية T260، نيوبورت كورب). تم تعديل مستوحد اللون لتوفير الانتاج مع عرض ~ الطيفية 1-10 نانومتر طول موجي حول مركز من 450-650 نانومتر على سبيل المثال. ويقترن هذا ثم خرج متماسك جزئيا إلى الألياف الضوئية المتعدد (Thorlabs AFS105/125Y) لتسليم ضوء متماسكة جزئيا إلى النظام.
تم تركيب الألياف البصرية في مرحلة التناوب بمحركات (ThorlabsPRM-1Z8 يقودها Thorlabs TDC001 تحكم) لتغيير زاوية الإضاءة. المرحلة الآلية، مع مصدر الضوء المرفقة، هي التي شنت على المسرح ثنائي الأبعاد XY الخطي (نيوبورت ILS50CC يقودها تحكم MFA-PPD نيوبورت)، والذي تم استخدامه لتحقيق التحولات في الطائرة من مصدر الضوء في زاوية معينة. - كشف: Lensfree التصوير المقطعي البصري هو تقنية قابلة للتطوير بحيث يمكن اختيار مجموعة للكشف عن وفقا لمتطلبات من التطبيقات من دون تغيير كبير في خطوات الحصول على الصور أو معالجة البيانات. في هذا التقرير، يعمل لدينا مجموعة أجهزة الاستشعار CMOS بعد 5 ميغا بيكسل، مع حجم بكسل من 2.2 ميكرون (IDS التصوير، UI-1485LE-M). يستخدم كاشف لتسجيل واسع مجال للرؤية (مثلا 24 ملم 2) الصور الثلاثية الأبعاد من العينات، التي تم وضعها مباشرة في الجزء العلوي من منطقة نشطة للكشف. إذا كان الإعداد التصوير المقطعي مزدوج محور يجب أن ينفذ 7، ينبغي للكشف عن 1يقام ليسوتو في مرحلة التناوب أفقي (فيما يتعلق جدول بصري) (على سبيل المثال Thorlabs RP-01) لتدوير العينة (مع كاشف) في الطائرة العادية إلى المحور البصري. 7
2. عينة تحضير
في حين lensfree التصوير المقطعي البصري يمكن صورة مجموعة متنوعة من الكائنات مثل الخلايا والكائنات الحية الدقيقة، فإننا سوف توضح المبادئ الأساسية عن طريق أداء ثلاثي الأبعاد المجهري لC. ايليجانس عينة.
- باستخدام مشرط أو ملعقة أ، تأخذ قطعة صغيرة من أجار من طبق بيتري الذي يحتوي على C. ايليجانس ثقافة. وهناك قطعة مكعب من عدة مليمترات على طول كل البعد تحتوي على مئات من الديدان الخيطية.
- ضع قطعة صغيرة من أجار في قارورة تحتوي على مادة البولي بروبيلين 1 مل دي المتأينة (دي) للمياه.
- دوامة بلطف ل0،5-1 دقيقة، وانتظر 10-15 دقيقة حتى الديدان تزحف من قطعة أجار في الماء DI.
- من أجلجمد مؤقتا الديدان، إضافة 1 مل من 5-10 ملي حل ليفاميزول (سيغما الدريخ)، وانتظر لمدة 10 دقيقة.
- ماصة 5-10 ميكروليتر من عينة من الجزء السفلي من قنينة، وشطيرة بين زلات الغلاف اثنين. يمكن وضع هذه العينة، التي تحتوي على عدد كبير من الديدان يجمد مؤقتا (على سبيل المثال 50-100 الديدان)، وعلى كاشف للبدء في الحصول على البيانات.
3. الحصول على البيانات
هنا، نحن تلخيص خطوات الحصول على الصور لتجربة الكثير نموذجي، الذي تم آليا باستخدام واجهة مخصصة وضعت ابفيف.
- ضبط زاوية الأولية للمرحلة التناوب إلى -50 درجة مئوية، حيث 0 درجة يتوافق مع الوضع العمودي من مصدر الضوء.
- ضبط الموقف الأولي للمرحلة XY إلى (0،0)، والذي هو موقف HOME.
- ضبط الوقت التعرض للكاشف للاستفادة من أفضل مجموعتها في مثل هذه الدينامية أن الصورة مشرقة وقت ممكن دون أي قaturated بكسل.
- دون تغيير زاوية للمرحلة التناوب، والقبض على 9 صور. عن كل صورة، حرك مرحلة XY إلى موقع جديد في شبكة مربعة 3X3 ان كل هذه التحولات صورة بواسطة ما يقرب من ربع بكسل مقارنة مع سابقتها. الحصول على المزيد من الصور في كل زاوية، على سبيل المثال في شبكة 6μ6، قد تحسن القرار اعتمادا على نوع الكائن، وإشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) 10
- ضبط الموقف الأولي للمرحلة XY إلى (0،0)، والذي هو موقف HOME.
- زيادة زاوية مرحلة التناوب بزيادات من 2 درجة مئوية، حتى تصل إلى +50 درجة. بعد كل طريقة، أي في كل زاوية جديدة، كرر الخطوات 3-5. يمكن أن تكون الزيادات زاوي أدق أو خشونة اعتمادا على تعظيم الاستفادة من الوقت في مقابل الحصول على قرار التصوير.
- (خطوة اختيارية إذا كان نظام التصوير المقطعي مزدوج هو محور لاستخدامها) تدوير مرحلة الأفقي الذي تم تنظيمها من قبل للكشف عن 90 درجة. ثم،كرر الخطوات 1-6.
4. تحليل البيانات
اتباع الخطوات 1-6 في القسم 3، مجموعة من 459 صور ويكتسب، والذي يحتوي على 9 الفرعي بكسل تحول الصور لكل من زوايا مختلفة للإضاءة 51. أولا، تتم معالجتها رقميا لكل مجموعة من 9 صور، وذلك باستخدام بكسل فائقة قرار خوارزميات 10، الحصول على واحدة عالية الدقة (HR) الهولوغرام إسقاط لكل زاوية. تجدر الإشارة إلى أن بيكسل فائقة يشير القرار إلى التغلب على الحد من حجم بكسل، بدلا من الحد الحيود، وعلى القرار المكانية من الصور lensfree. ثم يتم بكسل الصور ثلاثية الأبعاد فائقة حل بناؤها رقميا 7-10 للحصول على صور الإسقاط 51. هذه مجموعة من الصور إسقاط 51 ومن ثم العودة المتوقعة باستخدام TomoJ، والمكونات في ليماغيج (صورة مفتوحة المصدر برامج التحليل) 11 هذه العملية مرة أخرى الإسقاط إخراج صورة ثلاثية الأبعاد (tomograms) من العينة. على الرغم من عدم تنفيذها هنا،ويمكن أيضا نظام التصوير المقطعي المزدوج محور يمكن استخدامها على النحو المبين في المرجع. 7. في هذا المخطط، يتم الحصول على المجموعة الثانية من tomograms من خلال تناوب مصدر الضوء على امتداد محور متعامد فيما يتعلق محور دوران الاولى، والتي توفر المزيد من المعلومات المكانية المتعلقة عينة، ويحسن القرار المحوري.
5. ممثل النتائج
ويتجلى في حقل كبير للرؤية (FOV) من التصوير المقطعي lensfree بصري في الشكل 1. كما يتم وضع عينة مباشرة على الجزء العلوي من الصفيف، كاشف، يمكن تسجيل الصور الثلاثية الأبعاد من الكائنات على مدى ملم FOV من 24 2، والتي يمكن زادت من استخدام المصفوفات للكشف عن المناطق الناشئة مع أكبر نشط.
على الرغم من حجم بكسل من الصفيف، كشف يحد من قرار من الصور الثلاثية الأبعاد والمسجل، بكسل فائقة قرار تقنيات التخفيف من هذه المشكلة. ويبين الشكل 2 بكسل فائقة حل الهولوغرام على طولمع الصور التي أعيد بناؤها (صور إسقاط أي) التي تقدم شبه ميكرومتر القرار المكانية، لمدة ثلاث زوايا مختلفة من الإضاءة.
ويمكن الجمع بين هذه الصور الإسقاط باستخدام تقنيات تصوير الشعاعي الطبقي اعادة الاعمار صورة (على سبيل المثال تصفية الخلفية الإسقاط) لحساب tomograms (أي ثلاث صور ثلاثية الأبعاد) من العينة. ويبين الشكل 3 صور شريحة الثلاثة في طائرة س ص من خلال الأمامي للدودة، حيث أنبوب بلعومي مرئيا فقط في شريحة من خلال Z ميكرومتر = 8، كما هو متوقع من هذا الهيكل أسطواني تقريبا مع قطر ~ 5 ميكرومترات الخارجي. وعلاوة على ذلك، فإن صورة مقطعية في الطائرة XZ (أقحم في الشكل (3) أعلى لوحة) ويبين بوضوح حدود دودة وأنبوب بلعومي داخل (واشار من قبل سهام)، مما يدل على التصوير 3D الناجح للبلعوم.
ويبين الشكل 2 بكسل فائقة حل الصور المجسمة (اللوحة اليسرى)، وإسقاط الصور التي أعيد بناؤها رقميا (اللوحة اليمنى) لجيم ايليجانس دودة (اقتصاص من حقل كبير للرؤية، من) في ثلاث زوايا إضاءة مختلفة. كل صورة الإسقاط تحتوي على معلومات تتعلق بزاوية عرض مختلفة، والتي تمكن من حساب هيكل 3D من خلال عملية الإسقاط الخلفية التي تمت تصفيتها.
ويبين الشكل 3 tomograms المحسوبة لC. ايليجانس دودة سو الشكل رقم 2. (الصف الأعلى) يظهر صورة شريحة من الدودة كامل في زي ميكرومتر 3 =. وأقحم يظهر صورة مستعرضة من الأمامي للدودة. شريط مقياس أقحم هو 50 ميكرون. (الصف السفلي) يظهر صورا شريحة الثلاث من خلال الأمامي للدودة، مما يدل على القدرة البصرية باجتزاء من التصوير المقطعي البصري lensfree. الأسهم في جميع أنحاء الرقم يشير إلى نفس النقطة على أنبوب البلعوم من الدودة. وتقدم أيضا صورة مجهر (X40، 0.65-NA) للمقارنة البصرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من المهم التأكيد على أن علم الهندسة الفريدة من المجهري على رقاقة lensfree الثلاثية الأبعاد هي أساسية تمكن من تحقيق بكسل فائقة الدقة والتصوير تصوير الشعاعي الطبقي. منذ لا يفترض أن تكون الصور المسجلة صور الإسقاط كما هو الحال في التصوير اتصال غير متماسكة يقترب 12، ولكن يمكن إسقاط الصور المجسمة، وحيود الضوء ينتقل حتى يفتئت على كشف تصحيح رقميا بواسطة إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد. ولذلك، يمكن أن تشكل التغيرات في المسافة عينة إلى أجهزة الاستشعار. وعلاوة على ذلك، لأن المسافة عينة إلى أجهزة الاستشعار و~ وعادة 0،5-5 ملم، في حين يتم وضع مصدر ضوء على مسافة 4-10 سم ~ من العينة، وتحقيق الفرعي بكسل التحولات لا يتطلب تحولات مصدر كبير. ونتيجة لذلك، نقل مصدر الضوء الوحيد بواسطة 50-100 ميكرون غير كافية لتحقيق الفرعي بكسل التحولات في الطائرة للكشف، ومنع التغيرات غير المرغوب فيها في ط) إضاءة منظور الاتجاه /، 1الثانية والثاني) فعال عينة إلى الاستشعار عن بعد في كل موقف المصدر. إذا لم يمنع، يمكن لهذه الاختلافات تسبب الانحرافات الكبيرة في الصور بيكسل فائقة حلها. لذلك، في الواقع الهولوغرام سجلت في كل موضع المصدر، في زاوية معينة، يمكن أن يعتبر الفرعي بكسل الإصدارات تحول من صورة المجسم نفسه. وعلاوة على ذلك، فإن تصميم تقريبا المحاذاة خالية من التصوير المقطعي البصري lensfree يجعلها واضحة وليس لتسجيل الصور المجسمة الإسقاط في زوايا مختلفة، وذلك ببساطة عن طريق تناوب مصدر الضوء 7،9، أو استخدام مصادر الضوء متعددة (مثل المصابيح) في زوايا مختلفة 8.
LOT هي تقنية الناشئة التي توفر مساحة واسعة النطاق الترددي المنتج على رقاقة التصوير من العينات. الأهم من ذلك، فهي قابلة للتكنولوجيا التي سوف تستفيد كثيرا من المصفوفات للكشف عن الجيل المقبل. وهذا هو، كما أسرع والمكمل لاتفاقية مكافحة التصحر مع صفائف كاشف بكسل أكثر كثافة تصبح متاحة، سوف LOT كونتيتحسين nuously على حد سواء من حيث قرار حقل الرؤية، من والسرعة. هذه هي ميزة هامة من lensfree على رقاقة المجهر خلال المجهر الضوئي التقليدية، حيث يتم تحديد أداء والتصوير من قبل العديد من النظم الفرعية، التي تعوق زيادة مباشرة على جودة الصورة مع التقدم في التكنولوجيا الرقمية.
في ملخص، تمكن عالية الإنتاجية 3D المجهري للعينات على مدى حجم التصوير كبير، في هيكل مدمج، يمكن lensfree التصوير المقطعي البصري تكون مجموعة أدوات مفيدة للالمختبر على واحد في رقاقة النظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
