Summary
Lensfree óptico tomografia é uma técnica de microscopia tridimensional que oferece uma resolução espacial de menos de 1 uM × menos de 1 uM × menos de 3 M em X, Y e dimensões Z, respectivamente, ao longo de um grande volume de imagiologia de 15-100 milímetros
Abstract
Tomográfico de imagem tem sido uma ferramenta amplamente utilizado em medicina como ele pode fornecer informação tridimensional (3D) estrutural sobre objectos de escalas de tamanho diferentes. Em escalas micrómetro e milímetros, as modalidades de microscopia óptica encontrar utilização crescente, devido à natureza não-ionizante de luz visível, e da disponibilidade de um amplo conjunto de fontes de iluminação (tais como lasers e emissores de luz-diodos) e elementos de detecção (tais como grande formato CCD e CMOS detector de matrizes). Entre os recentemente desenvolvidos modalidades de microscopia óptica tomográficos, pode-se incluir tomografia de coerência óptica, a tomografia de difração óptica, tomografia projeção óptica e luz folhas de microscopia. 1-6 Estas plataformas fornecer imagens seccional de células, microorganismos e animais modelo, como C. elegans zebrafish, e embriões de camundongos.
3D existente imagers ópticos geralmente têm arquiteturas relativamente volumosos e complexos, limitando ªe disponibilidade destes equipamentos para laboratórios avançados, e impedindo a sua integração com lab-on-a-chip plataformas e chips microfluídicos. Para fornecer um microscópio tomográfica alternativa, que recentemente desenvolveu a tomografia óptica lensfree (LOT) como uma modalidade de tomografia de alto rendimento, compactos e de baixo custo óptica. 7 LOT descarta o uso de lentes e componentes ópticos volumosos e, em vez se baseia em multi-ângulo iluminação e computação digital para alcançar profundidade resolvido imagens de micro-objetos sobre um volume grande de imagens. Muita coisa pode espécime biológico imagem com uma resolução espacial de 1 m <x <1 m x <3 mm no X, Y e Z, respectivamente dimensões, mais de um volume grande de imagens de 15-100 mm 3, e pode ser particularmente útil para lab-on-a-chip plataformas.
Protocol
1. Configuração de imagens
LOT pode ser montado em um compacto e leve arquitetura campo-portátil 8, e, alternativamente, como um microscópio optofluidic com a capacidade de imagem seccional. 9 Neste relatório, no entanto, vamos descrever a configuração de imagem de base para uma implementação de bancada para tomografia de estática As amostras.
- Módulo de iluminação: no Lote, fontes de luz parcialmente coerentes, tais como emissores de luz de diodos (LEDs) podem ser utilizados. Para uma flexibilidade experimental, foi utilizado um monocromador com uma lâmpada de Xenon (Cornerstone T260, Newport Corp.) O monocromador foi ajustado para fornecer uma saída com ~ largura 1-10 nm de comprimento de onda espectral em torno de um centro de, por exemplo 450-650 nm. Esta saída parcialmente coerente é, então, acoplado a uma fibra multimodo óptica (Thorlabs AFS105/125Y) para fornecer luz parcialmente coerente para o sistema.
A fibra óptica é montada sobre uma fase de rotação motorizada (ThorlabsPRM-1Z8 impulsionado por Thorlabs TDC001 controlador) para alterar o ângulo de iluminação. A fase motorizada, com a fonte de luz ligado, é montado sobre um bidimensional fase XY linear (Newport ILS50CC impulsionado por Newport AMF-PPD controladores), que foi utilizado para alcançar no plano-turnos da fonte de luz num determinado ângulo. - Detecção: Lensfree tomografia óptica é uma tecnologia escalável de tal forma que a matriz do detector pode ser escolhido de acordo com os requisitos das aplicações sem alterar significativamente as etapas de aquisição de imagens ou o processamento de dados. Neste relatório, nós empregamos um sensor CMOS com 5 Mega Pixels, com um tamanho de pixel de 2,2 mM (IDS Imaging, UI-1485LE-M). O detector é utilizado para registar os amplo campo de visão (por exemplo 24 mm 2) imagens holográficas de amostras, que foram colocadas directamente no topo da área activa do detector. Se uma configuração tomografia de duplo eixo é para ser implementada 7, o detector deve umlso ser montado sobre uma fase de rotação horizontal (em relação à mesa óptica) (por exemplo Thorlabs RP-01) para rodar a amostra (em conjunto com o detector) no plano perpendicular ao eixo óptico. 7
2. Preparação da Amostra
Enquanto lensfree tomografia óptica pode imaginar uma variedade de objetos, tais como células e microorganismos, que irão ilustrar os princípios básicos através da realização de microscopia tridimensional de um C. elegans amostra.
- Usando um bisturi ou uma espátula, tomar um pequeno pedaço de agar a partir da placa de Petri contendo o C. elegans cultura. Um pedaço cúbico de vários milímetros ao longo de cada dimensão irá conter centenas de nemátodos.
- Coloque o pequeno pedaço de agar em um frasco de polipropileno contendo 1 ml de água desionizada (DI).
- Gentilmente vórtice para 0,5-1 min, e esperar por 10-15 minutos até que os vermes rastejar para fora da peça agar na água DI.
- A fim deimobilizar temporariamente os vermes, adicionar 1 ml de solução de 5-10 mM levamisole (Sigma-Aldrich) e aguardar 10 min.
- Pipetar 5-10 da amostra a partir do fundo do frasco, e sanduíche entre duas folhas de cobertura. Esta amostra, contendo um grande número de vermes temporariamente imobilizada (por exemplo, 50-100 vermes), pode ser colocado sobre o detector para iniciar a aquisição de dados.
3. Aquisição de Dados
Aqui, vamos resumir as etapas de aquisição de imagens para um experimento típico LOT, que foi automatizado usando um costume desenvolvido LabView interface.
- Ajustar o ângulo inicial da fase de rotação a -50 °, em que 0 ° corresponde à posição vertical da fonte de luz.
- Ajustar a posição inicial da fase de XY para (0,0), que é a posição inicial.
- Ajustar o tempo de exposição do detector para utilizar melhor a sua gama dinâmica de tal modo que a imagem é tão brilhante quanto possível, sem qualquer saturated pixels.
- Sem alterar o ângulo de fase de rotação, a captura de 9 imagens. Para cada imagem, mover a fase XY para uma nova posição em uma grade quadrada de 3x3 de tal modo que cada imagem desloca em cerca de um quarto de um pixel em relação à anterior. A aquisição de imagens em cada ângulo, por exemplo, em uma grade 6μ6, pode melhorar a resolução, dependendo do tipo de objecto e de sinal-para-ruído (SNR). 10
- Ajustar a posição inicial da fase de XY para (0,0), que é a posição inicial.
- Aumentar o ângulo de fase de rotação por incrementos de 2 °, até atingir 50 °. Após cada incremento, ou seja, em cada ângulo novo, repita os passos 3-5. Os incrementos angulares pode ser mais fina ou mais grossa, dependendo da otimização do tempo de aquisição versus resolução de imagem.
- (Passo opcional se um esquema de tomografia de duplo eixo é para ser utilizado) Rodar a fase horizontal no qual o detector está montado de 90 °. Em seguida,repita os passos 1-6.
4. Análise de Dados
Seguindo os passos 1-6 na Seção 3, um conjunto de 459 imagens é adquirido, que contém 9 sub-pixel imagens deslocadas para cada um dos 51 diferentes ângulos de iluminação. Primeiro, cada conjunto de 9 imagens é processados digitalmente, utilizando de pixel super-resolução algoritmos 10, para se obter uma alta resolução (HR) holograma de projecção por ângulo. Deve notar-se que o pixel de super-resolução refere-se a ultrapassar a limitação do tamanho do pixel, em vez do que o limite de difracção, sobre a resolução espacial das imagens lensfree. Pixel hologramas super-resolvidas são, então, reconstruiu digitalmente 7-10 para obter 51 imagens de projeção. Este conjunto de 51 imagens de projeção é, então, volta-projetada usando TomoJ, um plug-in para ImageJ (um open source software de análise de imagem) 11. Esta operação volta projeção gera uma imagem tridimensional (tomografias) da amostra. Apesar de não ser implementado aqui,um esquema de tomografia de duplo eixo poderia também ser utilizada como descrito na ref. 7. Neste esquema, um segundo conjunto de tomogramas é obtido pela rotação da fonte de luz ao longo de um eixo ortogonal em relação ao eixo de rotação em primeiro lugar, que fornece informação mais espacial em relação à amostra, e melhora a resolução axial.
5. Os resultados representativos
O grande campo de visão (FOV) de lensfree tomografia óptica é demonstrado na Figura 1. À medida que a amostra é colocada directamente sobre o topo do detector de matriz, as imagens holográficas de os objectos podem ser gravados ao longo de um milímetro FOV de 24 2, que pode ainda ser aumentada utilizando matrizes de detectores emergentes com maiores áreas activas.
Embora o tamanho do pixel do detector de arranjo de-limita a resolução das imagens gravadas holográficos, de pixel de super-resolução técnicas mitigar este problema. A Figura 2 mostra de pixel super-resolvidos hologramas ao longocom as imagens reconstruídas (ou seja, projeção de imagens) que oferecem sub-micrômetro resolução espacial, por três diferentes ângulos de iluminação.
As imagens de projecção podem ser combinados usando técnicas de reconstrução tomográficos de imagem (por exemplo, filtrada volta projecção-) para calcular tomogramas (isto é, três imagens tridimensionais) do espécime. Figura 3 mostra três imagens de corte no plano xy através da anterior do sem-fim, onde o tubo faríngeo é visível apenas na fatia através z = 8 mM, como esperado a partir desta estrutura cilíndrica com cerca de ~ 5 mM diâmetro exterior. Além disso, a imagem em corte transversal no plano xz (inserção na Figura 3 painel superior) mostra claramente as fronteiras do verme eo tubo interior da faringe (apontado pelas setas), demonstrando imagem 3D bem sucedida da faringe.
A Figura 2 mostra o pixel super-resolvidos hologramas (painel esquerdo) e as imagens reconstruídas digitalmente projecção (painel da direita) para um C. elegans worm (cortada de um grande campo de visão) em três ângulos diferentes de iluminação. Cada imagem de projecção contém informação sobre um ângulo de visão diferente, que permite o cálculo da estrutura 3D através de uma operação de volta filtrada projecção.
A Figura 3 mostra tomogramas calculados para a C. elegans verme of Figura 2. (Linha superior) mostra uma imagem de corte do verme inteiro em z = 3 mm. A inserção mostra uma imagem em corte transversal a partir do anterior do sem-fim. Barra de escala da inserção é de 50 mM. (Linha inferior) mostra três imagens de corte através do anterior do verme, demonstrando a capacidade de seccionamento óptico da tomografia óptica lensfree. As setas ao longo da figura indicam o mesmo ponto no tubo da faringe do sem-fim. Uma imagem de microscópio (x40, 0,65-NA) é também proporcionada para comparação visual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
É importante ressaltar que a geometria original de lensfree microscopia on-chip holográfico é o capacitador fundamental para alcançar pixels super-resolução e imagem tomográfica. Desde que as imagens gravadas não são consideradas como imagens de projeção de imagens em contato incoerente se aproxima de 12, mas hologramas de projeção, a difração da luz transmitida até que incide sobre o detector pode ser digitalmente corrigidas pela reconstrução holográfica. Portanto, as variações na distância-amostra para o sensor pode ser explicada-. Além disso, uma vez que a distância-amostra para o sensor é tipicamente ~~~V 0,5-5 mm, enquanto a fonte de luz é colocada em ~ 4-10 cm de distância a partir da amostra, a realização de subpixel turnos não requer deslocamentos de código de grandes dimensões. Como resultado, movendo-se a fonte de luz apenas por 50-100 uM é suficiente para alcançar sub-pixel deslocamentos no plano detector, impedindo variações indesejáveis em i) iluminação perspectiva direcção /, umnd ii) distância amostra-a-sensor eficaz em cada posição de origem. Se não impedido, estas variações podem causar aberrações significativas nas imagens de pixel super-resolvidos. Portanto, os hologramas gravados em cada posição de origem, a um determinado ângulo, pode realmente ser considerada como sub-pixel versões desviadas da mesma imagem holográfica. Além disso, o desenho quase-alinhamento livre de lensfree tomografia óptica torna bastante simples para gravar hologramas de projecção em ângulos diferentes, simplesmente por rotação de um fonte de luz 7,9, ou utilizando várias fontes de luz (tal como LEDs) em ângulos diferentes 8.
LOT é uma técnica emergente que oferece um espaço com produto banda-larga para on-chip de imagem de amostras. Importante, é uma tecnologia escalável, que irão se beneficiar com as matrizes de detectores de última geração. Ou seja, como mais rápido e matrizes de detectores CMOS CCD com pixels mais densas se tornam disponíveis, muita coisa vai contiforma contínua melhorar tanto em termos de resolução, campo de visão e velocidade. Esta é uma vantagem importante de lensfree on-chip mais de microscopia microscopia de luz convencional, onde o desempenho de imagem é determinado por vários sub-sistemas, o que dificulta o dimensionamento direto da qualidade de imagem com os avanços nas tecnologias digitais.
Em resumo, permitindo alto rendimento microscopia 3D de espécimes por um volume de imagem grande, em uma arquitectura compacta, lensfree tomografia óptico pode ser um conjunto de ferramentas úteis para lab-on-a-chip sistemas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
