Summary
Lensfree tomographie optique est une technique de microscopie en trois dimensions qui offre une résolution spatiale de moins de 1 um × <1 um x <3 microns en x, y et z dimensions, respectivement, au cours d'une imagerie grand volume de 15-100 mm
Abstract
Imagerie tomographique a été un outil largement utilisé en médecine comme il peut fournir en trois dimensions (3D) des informations structurelles relatives des objets de tailles différentes échelles. Dans les échelles micrométriques et millimétriques, les modalités de microscopie optique trouver une utilisation croissante en raison de la nature non-ionisant de la lumière visible, et la disponibilité d'un riche ensemble de sources d'éclairage (telles que les lasers et électro-luminescentes des diodes) et des éléments de détection (tels que grand format CCD et CMOS détecteur-arrays). Parmi les optiques récemment développés modalités microscopie tomographique, on peut inclure la tomographie par cohérence optique, la tomographie par diffraction optique, la tomographie optique de projection et de la lumière-feuille de la microscopie. 1-6 Ces plates-formes fournissent des images en coupe de cellules, micro-organismes et les animaux modèles tels que C. elegans, le poisson-zèbre et d'embryons de souris.
Existants 3D imageurs optiques ont généralement des architectures relativement encombrants et complexes, ce qui limite ee la disponibilité de ces équipements à des laboratoires de pointe, et d'empêcher leur intégration avec le laboratoire-sur-une-puce plates-formes et des puces microfluidiques. Pour fournir une solution de rechange microscope tomographique, nous avons récemment développé lensfree tomographie optique (LOT) comme une modalité tomographie optique à haut débit, compact et rentable. 7 rejets LOT l'utilisation de lentilles et de volumineux composants optiques, et repose plutôt sur multi-angle l'éclairage et de calcul numérique pour obtenir la profondeur d'imagerie à résolution de micro-objets sur une grande volume d'imagerie. LOT peut spécimen biologique à l'image d'une résolution spatiale de moins de 1 mm x <1 um x <3 um dans le x, y et z dimensions, respectivement, au cours d'une grande volume d'imagerie de 15-100 mm 3, et peut être particulièrement utile pour lab-on-a-chip plates-formes.
Protocol
1. Configuration d'imagerie
LOT peut être assemblé dans un compact et léger sur le terrain portable architecture 8, et, alternativement, comme un microscope optofluidic avec la capacité d'imagerie en coupe. 9 Dans ce rapport, cependant, nous allons décrire l'installation d'imagerie de base pour une mise en œuvre de paillasse vers la tomographie d'électricité statique échantillons.
- Module d'éclairage: dans le Lot, les sources de lumière partiellement cohérente comme émettrices de lumière des diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être utilisés. Pour plus de flexibilité expérimentale, nous avons utilisé un monochromateur avec une lampe au xénon (Cornerstone T260, Newport Corp). Le monochromateur est ajusté pour fournir un signal de sortie avec ~ 1-10 nm largeur spectrale autour d'un centre de longueur d'onde par exemple 450-650 nm. Cette sortie partiellement cohérent est ensuite couplé à une fibre optique multimode (Thorlabs AFS105/125Y) pour délivrer la lumière partiellement cohérente au système.
La fibre optique est monté sur une platine de rotation motorisée (ThorlabsPRM-1Z8 entraîné par Thorlabs TDC001 contrôleur) pour changer l'angle d'éclairage. L'étape motorisé, avec la source de lumière fixée, est montée sur une scène bidimensionnelle linéaire XY (Newport ILS50CC entraîné par Newport MAE-PPD contrôleurs), qui a été utilisé pour réaliser des changements dans le plan de la source de lumière sous un angle donné. - Détection: Lensfree tomographie optique est une technologie s'adaptent de telle sorte que le réseau de détecteurs peut être choisie en fonction des besoins des applications sans modifier sensiblement les étapes d'acquisition d'image ou le traitement des données. Dans ce rapport, nous avons utilisé un réseau de capteurs CMOS ayant 5 Mega Pixels, avec une taille de pixel de 2,2 microns (IDS Imaging, l'assurance-chômage 1485LE-M). Le détecteur est utilisé pour enregistrer les larges champ de vue (par exemple 24 mm 2) des images holographiques d'échantillons, qui ont été passées directement sur le dessus de la zone active du détecteur. Si une installation de tomographie à double axe est à mettre en œuvre 7, le détecteur si unlso être monté sur une platine de rotation (par rapport à la table optique) horizontale (par exemple Thorlabs RP-01) pour faire tourner l'échantillon (avec le détecteur) dans le plan normal à l'axe optique. 7
2. Préparation de l'échantillon
Alors que lensfree tomographie optique peut l'image d'une variété d'objets tels que des cellules et des micro-organismes, nous allons illustrer les principes de base en effectuant trois dimensions microscopique d'un C. elegans échantillon.
- L'utilisation d'un scalpel ou d'une spatule, prendre un petit morceau d'agar-agar de la boîte de Pétri contenant du C. elegans culture. Un morceau cube de quelques millimètres le long de chaque dimension contiendra des centaines de nématodes.
- Placer le bloc d'agar petite dans un flacon de polypropylène contenant 1 ml désionisée (DI) de l'eau.
- Doucement à vortex pour 0,51 mn, et attendre pendant 10-15 min jusqu'à ce que les vers sortent de la pièce agar dans l'eau DI.
- Afin deimmobiliser temporairement les vers, ajouter 1 ml de solution mM lévamisole 5-10 (Sigma-Aldrich) et attendre pendant 10 min.
- Pipeter pi 5-10 échantillon à partir du fond du flacon, et en sandwich entre deux lamelles. Cet échantillon, contenant un grand nombre de vers temporairement immobilisée (p.ex. 50-100 vers), peut être placé sur le détecteur à commencer l'acquisition de données.
3. Acquisition de données
Ici, nous résumons les étapes d'acquisition d'image pour une expérience typique de LOT, qui a été automatisée en utilisant une coutume développé LabView interface.
- Ajuster l'angle initial de la phase de rotation à -50 °, où 0 ° correspondant à la position verticale de la source de lumière.
- Ajustez la position initiale de la platine XY à (0,0), qui est la position HOME.
- Réglez le temps d'exposition du détecteur à utiliser au mieux sa gamme dynamique de telle sorte que l'image est aussi brillant que possible sans sPixel aturated.
- Sans changer l'angle de la table de rotation, de capturer des images 9. Pour chaque image, déplacez le platine XY à une nouvelle position dans une grille de 3x3 carrés de sorte que chaque image se déplace d'environ un quart de pixel par rapport à la précédente. Acquérir d'autres images à chaque angle, par exemple dans une grille 6μ6, peut améliorer la résolution en fonction du type de l'objet et le signal-sur-bruit (SNR). 10
- Ajustez la position initiale de la platine XY à (0,0), qui est la position HOME.
- Augmenter l'angle de rotation de l'étage par incréments de 2 °, jusqu'à atteindre 50 °. Après chaque incrément, c'est à dire à chaque nouvel angle, répétez les étapes 3-5. Les incréments angulaires peuvent être plus ou moins fin selon l'optimisation du temps d'acquisition par rapport à la résolution d'imagerie.
- (Étape optionnelle si un régime de tomographie par deux axes doit être utilisé) Tourner la scène horizontale sur laquelle le détecteur est monté à 90 °. Puis,répétez les étapes 1-6.
4. Analyse des données
Après les étapes 1-6 dans la section 3, un ensemble de 459 images est acquise, qui contient 9 sous-pixels des images décalées pour chacune des 51 sous différents angles d'illumination. Tout d'abord, chaque série de 9 images est traitée numériquement, à l'aide de pixels de super-résolution des algorithmes 10, pour obtenir un exemplaire haute résolution (HR) hologramme de projection par l'angle. Il convient de noter que le pixel de super-résolution se réfère à surmonter la limitation de la taille du pixel, plutôt que la limite de diffraction, la résolution spatiale des images lensfree. Pixel hologrammes super-résolus sont ensuite numériquement reconstruite 7-10 pour obtenir 51 images de projection. Cet ensemble de 51 images de projection est alors rétro-projetée à l'aide TomoJ, un plug-in pour ImageJ (un logiciel open source d'analyse d'images) 11. Cette opération de rétroprojection produit une image tridimensionnelle (tomographie) de l'échantillon. Bien que n'étant pas mis en œuvre ici,un système de tomographie à double axe pourrait également être utilisée comme décrit dans la réf. 7. Dans ce dispositif, un second ensemble de tomographies est obtenu en faisant tourner la source de lumière le long d'un axe orthogonal par rapport à l'premier axe de rotation, qui fournit des informations plus spatiale concernant l'échantillon, et améliore la résolution axiale.
5. Les résultats représentatifs
Le grand champ de vision (FOV) de lensfree tomographie optique est démontré dans la figure 1. Comme l'échantillon est placé directement sur la partie supérieure du détecteur-tableau, des images holographiques des objets peuvent être enregistrées sur une mm FOV de 24 2, qui peut encore être augmentée en utilisant des réseaux de détecteurs émergents avec de plus grandes zones actives.
Bien que la taille des pixels du détecteur à réseau limite la résolution des images enregistrées holographiques, des pixels de super-résolution des techniques d'atténuer ce problème. La figure 2 montre de pixels ultra-résolus hologrammes longavec les images reconstruites (images de projection par exemple) qui offrent des sub-micrométrique résolution spatiale, pour trois angles différents de l'illumination.
Les images de projection peuvent être combinés en utilisant des techniques de reconstruction tomographique d'image (par exemple rétroprojection filtrée) pour calculer des tomographies (c.-à-images en trois dimensions) de l'échantillon. La figure 3 montre trois images de coupe dans le plan xy par la partie antérieure du ver, où le Tube pharyngien n'est visible que dans la tranche grâce à z = 8 um, comme prévu à partir de cette structure à peu près cylindrique dont le diamètre ~ 5 um extérieure. En outre, l'image en coupe dans le plan xz (en médaillon dans la figure 3 panneau supérieur) montre clairement les limites de la vis sans fin et le tube pharyngé à l'intérieur (souligné par les flèches), ce qui démontre avec succès l'imagerie 3D du pharynx.
La figure 2 montre le pixel super-résolues hologrammes (panneau de gauche) et les images de projection reconstruites numériquement (panneau de droite) pour un C. ver elegans (recadrée à partir d'un grand champ de vue) à trois angles d'éclairage différents. Chaque image de projection contient des informations sur un angle de vision différent, ce qui permet le calcul de la structure 3D à travers une rétroprojection filtrée opération.
La figure 3 montre tomographies calculées pour la C. ver elegans oFigure f 2. (Rangée du haut) montre une image de tranche du ver ensemble, à z = 3 um. L'encart montre une image transversale de la partie antérieure du ver. La barre d'échelle de l'encart est de 50 um. (Rangée du bas) montre trois images de coupe à travers la partie antérieure du ver, ce qui démontre la capacité optique de sectionnement de la tomographie optique lensfree. Flèches travers la figure indiquent le même point sur le tube pharyngé de la vis sans fin. Une image au microscope (x40, 0,65 NA) est également fourni pour une comparaison visuelle.
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Discussion
Il est important de souligner que la géométrie unique de lensfree sur puce microscopie holographique est le catalyseur essentiel pour atteindre pixel de super-résolution et l'imagerie tomographique. Étant donné que les images enregistrées ne sont pas supposées être des images de projection comme dans l'imagerie de contact incohérente approche 12, mais des hologrammes de projection, la diffraction de la lumière transmise jusqu'à ce qu'il empiète sur le détecteur peut être corrigée par la reconstruction numérique holographique. Par conséquent, les variations de la distance de l'échantillon et le capteur peut être pris en compte. En outre, depuis la distance échantillon-à-capteur est généralement ~ de 0,5-5 mm, tandis que la source de lumière est placée à une distance ~ 4-10 cm de l'échantillon, réaliser des changements de sous-pixels ne nécessite pas de grands changements de source. À la suite, à déplacer la source de lumière seulement par 50-100 um est suffisante pour obtenir des changements de sous-pixels au niveau du plan détecteur, empêchant les variations indésirables en i) en perspective d'illumination direction /, une ii) efficace échantillon-à-capteur de distance à chaque position de source. Si ce n'est pas empêché, ces variations pourraient causer des aberrations significatives dans les images de pixels ultra-résolus. Par conséquent, les hologrammes enregistrés à chaque position de source, à un angle donné, peut effectivement être considéré comme sous-pixels versions décalées de la même image holographique. En outre, la conception presque sans alignement de tomographie optique lensfree rend plutôt simple pour enregistrer des hologrammes de projection à des angles différents, simplement en tournant une source de lumière 7,9, ou en utilisant plusieurs sources de lumière (tels que les LED) à des angles différents 8.
LOT est une technique émergente qui offre un grand espace de la bande passante produit sur puce d'imagerie d'échantillons. Surtout, il s'agit d'une technologie évolutive qui va grandement bénéficier des tableaux prochaines détecteurs de nouvelle génération. C'est, comme plus rapide CMOS et des réseaux de détecteurs CCD avec des pixels plus denses deviennent disponibles, LOT va contimanence améliorer à la fois en termes de résolution, le champ de vision et de la vitesse. C'est un avantage important de lensfree sur puce microscopique sur la microscopie optique conventionnelle, où la performance d'imagerie est déterminée par de multiples sous-systèmes, ce qui entrave la mise à l'échelle directe de la qualité d'image avec les progrès des technologies numériques.
En résumé, ce qui permet à haut débit microscopie 3D de spécimens sur un volume d'imagerie grand, dans une architecture compacte, lensfree tomographie optique peut être un ensemble d'outils utiles pour le laboratoire-sur-une-puce systèmes.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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