Summary
Lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी एक तीन आयामी माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि <1 माइक्रोन का एक स्थानिक संकल्प प्रदान करता है × <1 माइक्रोन × <3 एक्स, वाई और z आयाम, क्रमशः में 15-100 मिमी की एक बड़ी इमेजिंग मात्रा पर, माइक्रोन
Abstract
Tomographic इमेजिंग चिकित्सा में एक उपकरण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है के रूप में तीन आयामी (3 डी) संरचनात्मक अलग आकार तराजू की वस्तुओं के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. सुक्ष्ममापी और मिलीमीटर तराजू में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी रूपरेखा के बढ़ते उपयोग के दृश्य प्रकाश की गैर ionizing प्रकृति के कारण हैं, और रोशनी स्रोतों के एक अमीर सेट (जैसे लेज़रों और प्रकाश emitting-डायोड के रूप में) और पहचान के तत्वों (जैसे की उपलब्धता बड़े प्रारूप सीसीडी और CMOS डिटेक्टर arrays). हाल ही में विकसित ऑप्टिकल tomographic माइक्रोस्कोपी तौर तरीकों के अलावा, एक ऑप्टिकल जुटना tomography, ऑप्टिकल विवर्तन टोमोग्राफी, ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी और माइक्रोस्कोपी प्रकाश पत्र शामिल 1-6 इन प्लेटफार्मों कर सकते हैं. कोशिकाओं, सूक्ष्म जीवाणुओं, और सी के रूप में मॉडल पशुओं के अनुभागीय इमेजिंग प्रदान करते हैं एलिगेंस, zebrafish, और माउस भ्रूण.
मौजूदा 3 डी ऑप्टिकल imagers के आम तौर पर अपेक्षाकृत भारी और जटिल आर्किटेक्चर है, वें सीमितई उन्नत प्रयोगशालाओं के लिए इन उपकरणों की उपलब्धता, और प्रयोगशाला-on-a-चिप प्लेटफार्मों और microfluidic चिप्स के साथ अपने एकीकरण की बाधा. एक वैकल्पिक tomographic खुर्दबीन प्रदान करने के लिए, हम हाल ही में एक उच्च throughput, कॉम्पैक्ट, और लागत प्रभावी ऑप्टिकल टोमोग्राफी साधन के रूप में विकसित lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी (बहुत) 7 बहुत छोड देता है लेंस और भारी ऑप्टिकल घटकों के उपयोग, और के बजाय बहु कोण पर निर्भर करता है रोशनी और डिजिटल इमेजिंग बड़ी मात्रा अधिक गहराई हल सूक्ष्म वस्तुओं की इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए गणना. बहुत <1 माइक्रोन का एक स्थानिक संकल्प छवि पर x <1 माइक्रोन x <एक्स, वाई और z आयाम में 3 माइक्रोन, क्रमशः, 15-100 3 मिमी की एक बड़ी मात्रा इमेजिंग पर, और जा सकता है विशेष रूप से उपयोगी जैविक के लिए नमूना कर सकते हैं प्लेटफार्मों प्रयोगशाला-on-a-चिप.
Protocol
1. इमेजिंग सेटअप
बहुत एक कॉम्पैक्ट और हल्के क्षेत्र पोर्टेबल 8 वास्तुकला में इकट्ठा किया जा सकता है, और वैकल्पिक रूप से अनुभागीय इमेजिंग क्षमता के साथ एक optofluidic खुर्दबीन के रूप में इस रिपोर्ट फीट 9, तथापि, हम स्थैतिक का टोमोग्राफी की ओर एक पीठ टॉप कार्यान्वयन के लिए बुनियादी इमेजिंग की स्थापना का वर्णन करेंगे नमूने.
- रोशनी मॉड्यूल: बहुत, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के रूप में आंशिक रूप से सुसंगत प्रकाश स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है. प्रयोगात्मक लचीलेपन के लिए, हम एक क्सीनन दीपक (T260 आधारशिला, न्यूपोर्ट कार्पोरेशन) के साथ एक monochromator का इस्तेमाल किया. monochromator ~ 1-10 एनएम जैसे 450-650 एनएम के एक केंद्र तरंगदैर्ध्य के आसपास वर्णक्रमीय चौड़ाई के साथ एक निर्गम प्रदान करने के लिए समायोजित किया गया था. यह आंशिक रूप से सुसंगत उत्पादन तो एक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर (Thorlabs AFS105/125Y) प्रणाली के लिए आंशिक रूप से संसक्त प्रकाश देने के लिए युग्मित है.
ऑप्टिकल फाइबर एक motorized रोटेशन के मंच पर रखा है (ThorlabsPRM-1Z8 Thorlabs TDC001 नियंत्रक द्वारा संचालित) रोशनी के कोण बदलते हैं. मोटर मंच, प्रकाश स्रोत के साथ संलग्न है, एक दो आयामी रैखिक XY (न्यूपोर्ट ILS50CC न्यूपोर्ट एमएफए पीपीडी नियंत्रकों द्वारा संचालित) मंच है, जो किसी दिए गए कोण पर प्रकाश स्रोत के विमान में पाली को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था पर मुहिम शुरू की है. - पहचान: Lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी एक स्केलेबल ऐसी है कि डिटेक्तार सरणी काफी छवि अधिग्रहण कदम या डाटा प्रोसेसिंग को बदलने के बिना अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुसार चुना जा सकता है तकनीक है. इस रिपोर्ट में, हम एक CMOS संवेदक 5 मेगा पिक्सेल, 2.2 माइक्रोन (आईडी इमेजिंग, यूआई - 1485LE - एम) के एक पिक्सेल आकार के साथ, सरणी कार्यरत हैं. डिटेक्टर नमूनों की विस्तृत क्षेत्र के देखने के (जैसे 24 मिमी 2) holographic छवियों, जो सीधे डिटेक्टर सक्रिय क्षेत्र के शीर्ष पर रखा गया है रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यदि एक दोहरी अक्ष टोमोग्राफी सेटअप करने के लिए लागू किया जा रहा है 7, डिटेक्टर चाहिएlso एक क्षैतिज रोटेशन (ऑप्टिकल मेज के लिए सम्मान के साथ) (जैसे Thorlabs आर.पी. 01) चरण लिए ऑप्टिक अक्ष के लिए सामान्य विमान में नमूना डिटेक्टर (एक साथ) के साथ बारी बारी से करने पर रखा जा 7.
2. नमूना तैयार करना
जबकि lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी छवि कोशिकाओं और सूक्ष्मजीवों के रूप में की वस्तुओं की एक किस्म कर सकते हैं, हम एक सी. के तीन आयामी माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन से बुनियादी सिद्धांतों का उदाहरण देकर स्पष्ट करना होगा नमूना एलिगेंस.
- एक स्केलपेल या एक रंग का प्रयोग, पेट्री डिश से युक्त सी. से अगर एक छोटा सा टुकड़ा ले संस्कृति एलिगेंस. कई मिलीमीटर की प्रत्येक आयाम के साथ एक घन टुकड़ा नेमाटोड के सैकड़ों शामिल होंगे.
- अगर का छोटा सा हिस्सा एक polypropylene 1 मिलीलीटर पानी डे ionized है (डीआई) युक्त शीशी में रखें.
- धीरे 0.5-1 मिनट है, और 10-15 मिनट के लिए प्रतीक्षा जब तक कीड़े डि पानी में अगर टुकड़ा से बाहर क्रॉल करने के लिए भंवर.
- के लिएअस्थायी रूप से कीड़े स्थिर, 5-10 मिमी levamisole समाधान (सिग्मा Aldrich) के 1 मिलीग्राम जोड़ें और 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
- शीशी के नीचे से नमूना 5-10 μl, और दो कवर निकल जाता है के बीच सैंडविच विंदुक. यह नमूना, अस्थायी रूप से स्थिर कीड़े (जैसे 50-100 कीड़े) की एक बड़ी संख्या से युक्त, डाटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए डिटेक्टर पर रखा जा सकता है.
3. डाटा अधिग्रहण
यहाँ, हम एक विशिष्ट बहुत प्रयोग है, जो Labview इंटरफ़ेस विकसित कस्टम का उपयोग कर स्वचालित किया गया था के लिए छवि अधिग्रहण कदम संक्षेप.
- -50 °, 0 ° प्रकाश स्रोत के ऊर्ध्वाधर स्थिति से मेल खाती है रोटेशन चरण के प्रारंभिक कोण समायोजित करें.
- (0,0) XY मंच की प्रारंभिक स्थिति को समायोजित करने के लिए, जो घर की स्थिति है.
- डिटेक्टर के समय जोखिम को समायोजित सबसे अच्छा उपयोग अपने गतिशील रेंज कि छवि के बिना किसी भी रूप में संभव के रूप में उज्ज्वल हैaturated पिक्सल.
- रोटेशन चरण के कोण बदल के बिना, 9 छवियों पर कब्जा. प्रत्येक छवि के लिए, एक 3x3 वर्ग ऐसा है कि प्रत्येक छवि पिछले एक की तुलना में एक पिक्सेल का लगभग एक चौथाई से बदलाव ग्रिड में एक नई स्थिति के लिए XY मंच चाल. प्रत्येक कोण पर और अधिक छवियों को प्राप्त करने, 6μ6 ग्रिड में उदा, संकल्प वस्तु और संकेत से शोर अनुपात (SNR) के प्रकार के आधार पर सुधार 10. हो सकता है
- (0,0) XY मंच की प्रारंभिक स्थिति को समायोजित करने के लिए, जो घर की स्थिति है.
- 2 डिग्री के वेतन वृद्धि से 50 ° तक पहुँचने तक रोटेशन चरण के कोण, बढ़ाएँ. प्रत्येक वेतन वृद्धि के बाद, प्रत्येक नया कोण, दोहराने कदम 3-5 पर अर्थात्. कोणीय वेतन वृद्धि महीन या मोटे अधिग्रहण समय बनाम इमेजिंग संकल्प का अनुकूलन के आधार पर किया जा सकता है.
- (वैकल्पिक कदम है अगर एक टोमोग्राफी दोहरे अक्ष योजना के लिए उपयोग किया जा रहा है) क्षैतिज मंच है जिस पर डिटेक्टर 90 ° से मुहिम शुरू की है घुमाएँ. फिर,1-6 चरणों को दोहराएँ.
4. डेटा विश्लेषण
कदम धारा 3, 459 छवियों का एक सेट है हासिल कर ली है, जो 9 रोशनी के 51 अलग अलग कोण के प्रत्येक के लिए उप पिक्सेल स्थानांतरित छवियों में 1-6 के बाद. सबसे पहले, 9 छवियों के प्रत्येक सेट डिजिटल संसाधित है पिक्सेल सुपर संकल्प 10 एल्गोरिदम, का उपयोग करने के लिए (मानव संसाधन) कोण प्रति प्रक्षेपण होलोग्राम उच्च संकल्प प्राप्त है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पिक्सेल सुपर संकल्प पिक्सेल आकार की सीमा पर काबू पाने के लिए संदर्भित करता है, विवर्तन सीमा के बजाय lensfree छवियों के स्थानिक संकल्प पर,. पिक्सेल सुपर हल के होलोग्राम तो डिजिटल रहे हैं के लिए 51 प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करने के लिए 7-10 खंगाला. 51 प्रक्षेपण छवियों के इस सेट तो है TomoJ, प्लग में ImageJ (एक खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर) के लिए 11 इस वापस प्रक्षेपण आपरेशन नमूने के एक तीन आयामी छवि (tomograms) outputs. का उपयोग कर वापस अनुमान हालांकि यहां लागू नहींएक टोमोग्राफी दोहरे अक्ष योजना के भी रेफरी में वर्णित के रूप में उपयोग किया जा सकता है. 7. इस योजना में, tomograms की एक दूसरे सेट के पहले घूर्णन अक्ष है, जो अधिक स्थानिक नमूना के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और अक्षीय संकल्प में सुधार करने के लिए सम्मान के साथ एक orthogonal अक्ष के साथ में प्रकाश स्रोत rotating द्वारा प्राप्त की है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी के बड़े क्षेत्र के दृश्य (FOV) चित्रा 1 में प्रदर्शन किया है. के रूप में नमूना सीधे डिटेक्तार सरणी के शीर्ष पर रखा है, वस्तुओं की holographic छवियों को 24 की FOV 2 मिमी, जो आगे बड़ा सक्रिय क्षेत्रों के साथ उभरते डिटेक्टर arrays का उपयोग बढ़ कर सकते हैं पर दर्ज किया जा सकता है.
हालांकि डिटेक्तार सरणी के पिक्सेल आकार दर्ज holographic छवियों का संकल्प सीमा, पिक्सेल सुपर संकल्प तकनीक इस समस्या को कम करने के पिक्सेल सुपर हल होलोग्राम के साथ चित्रा 2 से पता चलता है.(यानी प्रक्षेपण छवियों) के साथ खंगाला छवियों है कि रोशनी के तीन अलग अलग कोण के लिए उप सुक्ष्ममापी स्थानिक संकल्प, प्रदान करते हैं.
प्रक्षेपण छवियों tomographic छवि पुनर्निर्माण तकनीक का उपयोग कर (जैसे फ़िल्टर वापस प्रक्षेपण) नमूना tomograms (यानी तीन आयामी छवियों) की गणना संयुक्त किया जा सकता है चित्रा 3 कृमि के पूर्वकाल के माध्यम से तीन xy विमान में छवियों टुकड़ा से पता चलता है, जहां ग्रसनी ट्यूब z = 8 माइक्रोन, के रूप में ~ 5 माइक्रोन बाहरी व्यास के साथ यह लगभग बेलनाकार संरचना से उम्मीद के माध्यम से टुकड़ा में ही दिखाई देता है. इसके अलावा, xz विमान में पार के अनुभागीय छवि (चित्रा 3 शीर्ष पैनल में इनसेट) स्पष्ट रूप से कृमि की सीमाओं और ग्रसनी ट्यूब के अंदर तीर द्वारा बताया, ग्रसनी की सफल 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन को दर्शाता है.
चित्रा 2 एक सी सुपर हल (बाएं पैनल) होलोग्राम और डिजिटल खंगाला प्रक्षेपण छवियाँ (सही पैनल) पिक्सेल के लिए दिखाता है तीन अलग अलग रोशनी कोण पर एलिगेंस कीड़ा (एक बड़े क्षेत्र के देखने से फसल). प्रत्येक प्रक्षेपण छवि एक अलग कोण को देखने, जो फ़िल्टर्ड वापस प्रक्षेपण आपरेशन के माध्यम से 3 डी संरचना की गणना के लिए सक्षम बनाता है के बारे में जानकारी शामिल हैं.
चित्रा 3 सी. लिए गणना tomograms के पता चलता है एलिगेंस कीड़ा ओच चित्रा 2. (शीर्ष पंक्ति) z = 3 माइक्रोन में पूरे कीड़ा का एक टुकड़ा छवि से पता चलता है. इनसेट कृमि के पूर्वकाल से एक पार के अनुभागीय छवि को दर्शाता है. इनसेट के पैमाने बार 50 माइक्रोन है. (नीचे पंक्ति) कृमि के पूर्वकाल के माध्यम से तीन टुकड़ा छवियों को दिखाता है, lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता का प्रदर्शन. आंकड़ा भर तीर कृमि के ग्रसनी ट्यूब पर एक ही बिंदु से संकेत मिलता है. एक माइक्रोस्कोप छवि (x40, 0.65-एनए) भी दृश्य तुलना के लिए प्रदान की जाती है.
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Discussion
यह महत्वपूर्ण है पर जोर देना है कि lensfree पर चिप holographic माइक्रोस्कोपी अद्वितीय ज्यामिति सुपर संकल्प पिक्सेल और tomographic इमेजिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण enabler है. के बाद से दर्ज की छवियों प्रक्षेपण छवियों के रूप में बेतुका संपर्क इमेजिंग में 12 दृष्टिकोण ग्रहण नहीं कर रहे हैं, लेकिन प्रक्षेपण होलोग्राम, पारेषित प्रकाश के विवर्तन जब तक यह डिटेक्टर पर impinges डिजिटल holographic पुनर्निर्माण द्वारा सुधारा जा सकता है. इसलिए, नमूना करने के लिए सेंसर दूरी में बदलाव जिम्मेदार हो सकता है. इसके अलावा, नमूना करने के लिए सेंसर दूरी के बाद से आमतौर पर 0.5-5 मिमी ~~ है, जबकि प्रकाश स्रोत ~ 4-10 नमूना से सेमी दूरी पर रखा गया है, उप पिक्सेल पाली को प्राप्त करता है बड़ा स्रोत परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है. एक परिणाम के रूप में, केवल 50-100 माइक्रोन से प्रकाश स्रोत चलती डिटेक्टर विमान में उप पिक्सेल पाली, मैं में अवांछित बदलाव को रोकने) रोशनी / दिशा परिप्रेक्ष्य, एक को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैएन डी ii) प्रत्येक स्रोत की स्थिति में प्रभावी दूरी नमूना करने के लिए सेंसर. अगर रोका नहीं, इन बदलावों पिक्सेल छवियाँ सुपर हल में महत्वपूर्ण aberrations का कारण बन सकता है. इसलिए, प्रत्येक स्रोत की स्थिति में किसी भी कोण पर, दर्ज होलोग्राम, वास्तव में ही holographic छवि के उप पिक्सेल स्थानांतरित संस्करणों पर विचार किया जा सकता है. इसके अलावा, lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी के लगभग संरेखण मुक्त डिजाइन बल्कि यह बस एक प्रकाश स्रोत घूर्णन 7,9, या विभिन्न कोणों से कम 8 कई प्रकाश स्रोतों (जैसे एल ई डी के रूप में) का उपयोग करके विभिन्न कोणों पर प्रक्षेपण होलोग्राम, रिकॉर्ड करने के लिए सरल बनाता है.
बहुत एक उभरती तकनीक है कि नमूनों की इमेजिंग पर चिप के लिए एक बड़ी अंतरिक्ष बैंडविड्थ उत्पाद प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात, यह एक परिमाप्य प्रौद्योगिकी है कि अगली पीढ़ी डिटेक्टर arrays से बहुत लाभ होगा. यही कारण है, के रूप में तेजी से CMOS और सीसीडी डिटेक्टर arrays denser पिक्सल के साथ उपलब्ध हो जाते हैं, बहुत conti होगाnuously संकल्प, क्षेत्र के दृश्य और गति के मामले में दोनों में सुधार होगा. यह माइक्रोस्कोपी चिप पर एक lensfree की महत्वपूर्ण पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी, जहां इमेजिंग प्रदर्शन कई उप प्रणालियों के द्वारा निर्धारित किया जाता है, डिजिटल प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के साथ छवि गुणवत्ता के प्रत्यक्ष स्केलिंग बाधा से अधिक लाभ है.
सारांश में, एक कॉम्पैक्ट वास्तुकला में एक बड़ी इमेजिंग मात्रा पर उच्च throughput नमूनों की 3 डी माइक्रोस्कोपी, सक्रिय करने के है, lensfree ऑप्टिकल टोमोग्राफी प्रयोगशाला-on-a-चिप सिस्टम के लिए एक उपयोगी toolset हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
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