Summary
lensfree光学断层扫描是一个立体显微镜技术，提供了一个<1微米的空间分辨率×<1微米×<3微米，在X，Y和Z尺寸，分别超过15-100毫米大成像容积
Abstract
层析成像已在医学上广泛使用的工具，因为它可以提供三维（3D）结构信息，对于大小不同尺度的对象。在微米和毫米尺度，光学显微镜的方式发现，由于越来越多地使用非电离性的可见光，并提供一套丰富的照明光源（如激光器和发光二极管）和检测元件（如大幅面CCD和CMOS探测器阵列）。在最近开发的光学层析显微镜的方式，可以包括光学相干断层扫描，衍 射光断层扫描，光学投影层析成像和光表镜。1-6这些平台提供的细胞，微生物和动物模型如 C截面成像线虫 ，斑马鱼和小鼠胚胎。
现有的3D光学成像一般都比较笨重和复杂的结构，限制日é可用性，这些设备先进的实验室，并妨碍他们的实验室在一个芯片平台和微流控芯片的集成。提供一种替代的断层显微镜，我们最近开发的一个高通量，结构紧凑，成本效益的光学断层扫描方式lensfree光断层扫描（很多）。7拍镜头和笨重的光学元件的使用将被丢弃，而不是依靠多角度照明和数字计算，实现了一个大的成像量深度解决微型物体的成像。很多形象在<1微米的空间分辨率X <1微米x <3微米，在X，Y和Z尺寸，分别超过了15-100毫米3大成像容积，并就特别有用的生物标本实验室在一个芯片平台。
Protocol
1。影像设定
很多，可以在一个紧凑和轻巧便携领域的架构8组装，或者optofluidic显微镜截面成像能力。9在这份报告中，但是，我们会向静态描述断层成像为台式实施的基本设置样品。
- 照明模块：地段，部分相干光源，如发光二极管（LED）可以利用。实验的灵活性，我们使用了氙气灯的单色（T260基石，新港公司）。单色仪的调整，以提供一个〜1-10纳米围绕一个中心， 如 450-650纳米波长的光谱宽度的输出。那么，这部分相干输出耦合到多模光纤的纤维（Thorlabs AFS105/125Y）提供部分相干光系统。
光纤安装在一个电动的旋转舞台（ThorlabsPRM - 1Z8驱动Thorlabs TDC001控制器）来改变照明角度。机动阶段，光源，安装在一个两维的直线的XY阶段（新港ILS50CC由新港外交部的PPD控制器驱动），这是用来实现在一个特定的角度，光源平面的变化。 - 检测：Lensfree光断层扫描是一种可扩展的探测器阵列可以根据应用要求选择没有显着变化的图像采集步骤或数据处理技术等。在这份报告中，我们采用的2.2微米像素大小（IDS成像，UI-1485LE-M）的500万像素，CMOS传感器阵列。探测器是用来记录宽领域的视图（ 如 24毫米2）全息图像样本，其中直接放置在顶部的探测器的有效面积。如果双轴断层扫描设置是实施7，探测器应莱索托被安装在水平（光表）旋转阶段（ 如 Thorlabs RP-01）在正常视神经轴的平面旋转的样品（连同探测器）7。
2。样品制备
虽然lensfree光学断层扫描图像的各种对象，如细 胞和微生物，我们将说明执行的C.立体显微镜的基本原则线虫样本。
- 使用手术刀或压舌板，采取的Petri包含了 C盘的琼脂小块线虫文化。一个立方米一块几毫米，沿着每个维度将包含数百线虫。
- 聚丙烯小瓶含1 mL去离子（DI）水将琼脂小块。
- 轻轻涡0.5-1分钟，等待10-15分钟，直至蠕虫爬行到DI水的琼脂块。
- 以暂时固定蠕虫，加1毫升5-10毫米左旋咪唑溶液（Sigma-Aldrich公司），并等待10分钟。
- 吸取5-10微升样品小瓶底部，两盖玻片和三明治。这个范例中，含有大量的临时固定的蠕虫（ 如 50-100蠕虫），可放置在探测器上启动数据采集。
3。数据采集
在这里，我们总结为一个典型的大量实验，这是由自动使用一个自定义开发的LabVIEW接口的图像采集步骤。
- 调整旋转舞台的初始角度-50°，0°对应的垂直位置的光源。
- 调整的XY阶段的初始位置为（0,0），这是起始位置。
- 调整探测器的曝光时间，以最好地利用其动态范围，这样的形象是没有任何S尽可能明亮aturated像素。
- 在不改变角度的旋转舞台，捕捉9张图像。每幅图像，移动XY工作台在一个3x3的方格，比前一个大约有四分之一像素，每个图像转移到新的位置。在各个角度获取更多的图像， 例如在6μ6电网，可能会提高分辨率取决于对象的类型和信号噪声比（SNR）10。
- 调整的XY阶段的初始位置为（0,0），这是起始位置。
- 增加2°递增，直至达到50°角度的旋转舞台。每个增量后， 即在每一个新的角度，重复步骤3-5。角增量可以更细或更粗，根据收购时间与成像分辨率的优化。
- （可选步骤，如果一个双轴断层计划是利用）旋转90°安装探测器的水平阶段。然后，重复步骤1-6。
4。数据分析
继步骤1-6在第3节，收购了459图像集，其中包含9个子像素转向照明的51个不同的角度的图像。首先，每套9张图像数字化处理，使用像素超高分辨率算法10，获得一个高分辨率（HR）投影每个角的全息图。应当指出的像素的超高分辨率，是指克服像素大小的限制，而不是衍射极限lensfree图像的空间分辨率。像素的超级解决全息图，然后以数字7-10获得51投影图像重建。这套51投影图像，然后背投影使用TomoJ，插件ImageJ的（一个开源的图像分析软件）11背投影操作。输出样本（tomograms）一个三维图像。虽然这里不落实，双轴断层计划也可以利用在文献中所述。 7。在这个方案中，第二组的tomograms方面的第一个旋转轴，它提供了更多的空间信息有关的样本，并提高轴向分辨率的正交轴沿旋转光源。
5。代表结果
大视场的视角（FOV）lensfree光断层扫描显示在图1。作为样品被直接放置在探测器阵列的顶部，物体的全息图像可以记录超过24个视野2毫米，可进一步增加新兴探测器阵列用较大的活跃的地区。
虽然探测器阵列的像素大小限制记录的全息图像的分辨率，像素的超高分辨率技术缓解这一问题。 图2显示像素的超级解决的全息图沿提供三个不同的角度照明亚微米的空间分辨率，图像重建（ 即投影图像）。
投影图像可以合并使用断层图像重建技术（ 如滤波反投影）计算试样tomograms（ 即三维图像）。 图3显示了在xy平面的切片图像通过蠕虫的前三个，其中咽管是可见的，只有在通过Z = 8微米，预计从这个〜5微米外径大致圆柱形结构切片。此外，在xz平面的截面图像（ 图3顶部面板中插图）清楚地表明了该蠕虫的边界和咽管内（箭头指向），展示咽成功的三维成像。
图2显示像素为C。超分辨全息图（左图）和数字重建投影图像（右图） 线虫蠕虫在三个不同光照角度（从一个大场的视图裁剪）。对于不同的视角，使通过滤波反投影操作的三维结构计算每个投影图像中包含的信息。
图3显示的C.计算tomograms 线虫蠕虫ØF 图2。 （上排）显示了整个蠕虫在Z = 3微米的切片图像。插图显示了从蠕虫前横断面图像。插图比例尺为50μm。 （下排）显示通过蠕虫的前三个切片图像，展示lensfree光断层扫描光学切片能力。整个图中的箭头指示蠕虫的咽管的相同点。还提供了一个显微镜图像（X40，0.65-NA）的视觉比较。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
重要的是要强调的是独特的几何lensfree片上的全息显微实现像素的超高分辨率层析成像的关键推动者。由于录制的影像不认为是投影图像在语无伦次接触成像接近12，但投影全息图 ，透射光衍射，直到它撞击探测器可以数字全息重建纠正。因此，在样品到传感器的距离变化可占。此外，由于样品到传感器的距离通常~~ 0.5-5毫米，而光源放置在〜4-10厘米的距离从样品，实现亚像素的变化，不需要大源转变。因此，移动仅50-100微米的光源是足够的，以实现在探测器平面的子像素的变化，防止意外的变化在我）照明方向/角度，ND 二）有效样本传感器在每个源位置的距离。如果不能阻止，这些变化可能导致在超分辨的像素的图像显着的畸变。因此，在每个源的位置，在一个特定的角度，记录的全息图，实际上可以被认为是相同的全息图像子像素移出版本。此外，几乎对准无lensfree光断层扫描设计，使得它相当简单，只需旋转光源7,9，或使用多个光源（如LED），在不同的角度8，记录在不同角度的投影全息。
地段是一个新兴的技术，提供了一个空间大带宽的芯片样品的成像产品。重要的是，它是一个可扩展的技术，这将大大受益于下一代探测器阵列。也就是说，作为更快的密度像素的CMOS和CCD探测器阵列可用，很多孔蒂nuously决议，实地查看和速度方面都提高。这是一个比传统的光学显微镜，成像性能是由多个子系统，数字技术的进步，阻碍直接缩放的图像质量的lensfree片上显微镜的重要优势。
总之，在一个紧凑的结构，使一个大的成像量高通量3D显微镜标本，lensfree光断层扫描可以是一个有用的工具集实验室的单芯片系统。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
