Summary
Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van <1 um heeft x <1 um x <3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100 mm
Abstract
Tomografische beeldvorming is een veel gebruikt hulpmiddel in de geneeskunde als het kan drie-dimensionale (3D) structurele informatie over de objecten van verschillende grootte weegschalen leveren. In micrometer en millimeter schalen, optische microscopie voorwaarden te bepalen in toenemende mate gebruik als gevolg van de niet-ioniserende karakter van zichtbaar licht, en de beschikbaarheid van een rijke set van verlichting bronnen (zoals lasers en light-emitting-diodes) en detectie-elementen (zoals groot formaat CCD-en CMOS-detector-arrays). Onder de recent ontwikkelde optische microscopie tomografische modaliteiten, kan men onder andere optische coherentie tomografie, optische diffractie tomografie, optische projectie tomografie en licht-sheet microscopie. 1-6 Deze platforms bieden sectionele beeldvorming van cellen, micro-organismen en model dieren, zoals C. elegans, zebravis en muis embryo's.
Bestaande 3D optische warmtebeeldcamera's hebben over het algemeen relatief omvangrijke en complexe architecturen, het beperken van ee beschikbaarheid van deze apparatuur tot geavanceerde laboratoria, en belemmeren de integratie daarvan met lab-on-a-chip platforms en microfluïdische chips. Om een alternatief tomografische microscoop te bieden, hebben we recent ontwikkelde lensfree optische tomografie (LOT) als een high-throughput, compacte en kosten-effectieve optische tomografie modaliteit. 7 LOT teruggooi het gebruik van lenzen en omvangrijke optische componenten, en in plaats daarvan is gebaseerd op multi-angle verlichting en digitale berekening om diepte-opgelost beeldvorming van micro-objecten te bereiken over een grote beeldvorming volume. Kan veel beeld biologisch monster met een spatiale resolutie van <1 um x <1 um x <3 micrometer in de x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot beeldvolume van 15-100 mm 3, en kan bijzonder nuttig voor lab-on-a-chip platforms.
Protocol
1. Imaging Setup
LOT kan worden gemonteerd in een compacte en lichte veld-draagbare architectuur 8, en subsidiair als een optofluidic microscoop met sectionale beeldvorming vermogen. 9 In dit rapport, maar we zullen de basis-imaging opzet voor een bench-top implementatie te beschrijven in de richting van tomografie van statische monsters.
- Verlichting Module: in de Lot, gedeeltelijk coherent licht bronnen, zoals light-emitting-diodes (LED's) kunnen worden gebruikt. Voor experimentele flexibiliteit, hebben we gebruik gemaakt van een monochromator met een Xenon lamp (Cornerstone T260, Newport Corp). De monochromator werd op een uitgang met 1-10 nm ~ spectrale breedte rond een golflengte van bijvoorbeeld 450 tot 650 nm voorzien. Deze gedeeltelijk coherent uitgang wordt dan gekoppeld met een multimode optische vezel (Thorlabs AFS105/125Y) gedeeltelijk coherent licht leveren aan het systeem.
De optische vezel is aangebracht op een motorisch draaibare fase (ThorlabsPRM-1Z8 gedreven door Thorlabs TDC001 controller) om de hoek van de verlichting te veranderen. De motor fase met de lichtbron verbonden is gemonteerd op een twee-dimensionale lineaire kruistafel (Newport ILS50CC aangedreven door Newport MFB-PPD controllers), die gebruikt werd in-vlak verschuivingen van de lichtbron bereiken bij een bepaalde hoek. - Detectie: Lensfree optische tomografie is een schaalbare technologie zodanig dat de detector-array kan worden gekozen op basis van de eisen van de applicaties zonder significant veranderen van het imago overname stappen of de verwerking van gegevens. In dit rapport hebben wij gebruik van een CMOS-sensor array met 5 megapixels, met een pixelgrootte van 2,2 micrometer (IDS Imaging, UI-1485LE-M). De detector wordt gebruikt om het brede gebied-van-weergave (bijv. 24 mm 2) holografische beelden van monsters, die rechtstreeks aan de bovenkant van het actieve gebied van de detector te nemen. Als een twee-assige opstelling tomografie wordt uitgevoerd 7 de detector eenlso gemonteerd op een horizontaal (ten opzichte van de optische tabel) draaiing fase (bijvoorbeeld Thorlabs RP-01) verdund (samen met de detector) draaien in het vlak loodrecht op de optische as 7.
2. Monstervoorbereiding
Terwijl lensfree optische tomografie kan het imago van een verscheidenheid aan objecten zoals cellen en micro-organismen, illustreren we de basisprincipes door het uitvoeren van driedimensionale microscopie van een C. elegans monster.
- Met een scalpel of spatel nemen een stukje agar van de petrischaal met het C. elegans cultuur. Een kubieke stuk van enkele millimeters langs elke dimensie bevat honderden van nematoden.
- Plaats de kleine brok van agar-agar in een polypropyleen flacon bevat 1 ml gedeïoniseerd (DI) water.
- Voorzichtig vortex voor 0,5-1 min, en wacht 10-15 minuten totdat de wormen kruipen van de agar stuk in de DI-water.
- Om tetijdelijk immobiliseren de wormen, voeg 1 ml van 5-10 mM levamisol oplossing (Sigma-Aldrich) en wacht 10 minuten.
- Pipetteer 5-10 ul van het monster uit de bodem van de flacon en sandwich tussen twee dekglaasjes. Dit monster, die een groot aantal tijdelijk geïmmobiliseerd wormen (bijv. 50-100 wormen) kan worden geplaatst op de detector data acquisitie starten.
3. Data Acquisition
Hier vatten we de beeldacquisitie stappen voor een typische LOT experiment, dat werd geautomatiseerd met behulp van een op maat ontwikkelde LabView-interface.
- Stel de beginhoek van de rotatie fase tot -50 °, waarbij 0 ° komt overeen met de verticale positie van de lichtbron.
- Stel de beginpositie van de XY stadium (0,0), de uitgangspositie.
- Pas de belichting van de detector optimaal gebruik maken van haar dynamisch bereik, zodanig dat het beeld is zo helder mogelijk, zonder saturated pixels.
- Zonder de rotatiehoek fase vastleggen 9 beelden. Voor elk beeld, beweeg de kruistafel naar een nieuwe positie in een 3x3 vierkant rooster, zodanig dat elk beeld verschuift met ongeveer een kwart van een pixel in vergelijking met de vorige. Verwerven meer beelden in elke hoek, bijvoorbeeld in een 6μ6 raster kunnen verbeteren resolutie, afhankelijk van het type van het object en signaal-ruisverhouding (SNR) 10.
- Stel de beginpositie van de XY stadium (0,0), de uitgangspositie.
- Verhoging van de rotatiehoek fase met stappen van 2 °, tot aan 50 °. Na elk increment, dat wil zeggen bij iedere nieuwe hoek, herhaalt u de stappen 3-5. De hoekige stappen kan fijner of grover zijn, afhankelijk van de optimalisatie van de overname tijd vs beeldvorming resolutie.
- (Optioneel stap als een twee-assige tomografie regeling moet worden gebruikt) Draai de horizontale podium waarop de melder is gemonteerd door de 90 °. Vervolgensherhaalt u stap 1-6.
4. Data-analyse
Na de stappen 1-6 in punt 3 een reeks van 459 beelden wordt verkregen, waarvan 9 sub-pixel verschoven beeld elk van de 51 verschillende lichtinvals bevat. Eerst wordt elke reeks beelden 9 digitaal worden verwerkt via pixel superresolutie algoritmen 10 een hoge resolutie (HR) projectie hologram per hoek verkrijgen. Opgemerkt die pixel superresolutie verwijst naar het overwinnen van de beperking van het aantal pixels in plaats van de diffractielimiet op de ruimtelijke resolutie van lensfree beelden. Pixel super-opgelost hologrammen zijn vervolgens digitaal gereconstrueerd 7-10 tot 51 projectie beelden te verkrijgen. Deze set van 51 projectie beelden is dan weer terug-geprojecteerd met behulp van TomoJ, een plug-in voor ImageJ (een open source software voor beeldanalyse). 11 Dit back-projectie bedrijf voert een drie-dimensionaal beeld (tomograms) van het monster. Hoewel hier niet toegepast,een twee-assige tomografie regeling kan ook worden gebruikt zoals beschreven in Ref. 7. In dit schema wordt een tweede reeks tomograms verkregen door rotatie van de lichtbron langs een orthogonale assen ten opzichte van de eerste rotatie-as, die meer ruimtelijke informatie over het monster bevat, en verbetert axiale resolutie.
5. Representatieve resultaten
Het grote beeldveld (FOV) van lensfree optische tomografie blijkt uit figuur 1. Als voorbeeld wordt rechtstreeks op de bovenkant van de detector-array kan holografische beelden van de objecten worden opgenomen gedurende een beeldveld van 24 mm 2, die verder kan worden verhoogd met behulp van nieuwe detector arrays met grotere actieve gebieden.
Hoewel de pixelgrootte van de detector-array beperkt de resolutie van de opgenomen holografische beelden, pixel super-resolutie technieken verminderen van dit probleem. Figuur 2 toont pixel super-opgelost hologrammen meemet de gereconstrueerde foto's (dat wil zeggen projectie beelden) dat sub-micrometer ruimtelijke resolutie aan te bieden, voor drie verschillende hoeken van de verlichting.
De projectie beelden kunnen gecombineerd worden met tomografische beeldreconstructie technieken (bijvoorbeeld gefilterd back-projectie) te tomograms (dwz drie dimensionale beelden) van het monster te berekenen. Figuur 3 toont drie slice afbeeldingen in het xy-vlak door de voorste van de worm, waar de keelholte buis is alleen zichtbaar in de plak door z = 8 urn, zoals verwacht uit deze ongeveer cilindrische structuur ~ 5 urn diameter. Bovendien is de cross-sectionele beeld in het XZ-vlak (inzet in figuur 3 bovenste paneel) toont duidelijk de grenzen van de worm en de faryngeale buis binnen (gewezen door de pijlen), waaruit blijkt succesvolle 3D-beeldvorming van de keelholte.
Figuur 2 toont de pixel super-opgelost hologrammen (links) en de digitaal gereconstrueerde projectiebeelden (rechts) een C. elegans worm (bijgesneden van een groot veld-of-view) op drie verschillende verlichting hoeken. Elk uitsteeksel beeld bevat informatie over een andere gezichtshoek, waarbij berekening van de 3D-structuur kan door een gefilterd terugprojectie werking.
Figuur 3 toont berekend tomograms de C. elegans worm of Figuur 2. (Bovenste rij) toont een plak beeld van de hele worm op z = 3 micrometer. De inzet toont een dwarsdoorsnede beeld van het voorste deel van de worm. Schaal balk van de inzet is 50 micrometer. (Onderste rij) toont drie slice beelden via de voorste van de worm, het aantonen van de optische sectie vermogen van lensfree optische tomografie. Pijlen in de figuur geven hetzelfde punt op de keelholte buis van de worm. Een microscoop beeld (x40, 0,65-NA) is ook voorzien voor de visuele vergelijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is belangrijk te benadrukken dat de unieke geometrie van lensfree on-chip holografische microscopie is de kritische factor om pixel super-resolutie en tomografische beeldvorming te bereiken. Aangezien de opgenomen beelden niet verondersteld projectiebeelden zoals onsamenhangend contact imaging nadert 12, maar projectie hologrammen de buiging van het doorgelaten licht tot het afbreuk doet aan de detector digitaal gecorrigeerd holografische reconstructie. Daarom kan variaties in de bemonsteringsfrekwentie tot sensor afstand worden verwerkt. Bovendien is sinds het monster tot sensor afstand gewoonlijk op ~ 0,5-5 mm, terwijl de lichtbron geplaatst ~ 4-10 cm afstand van het monster bereiken deelelement verschuivingen niet vereist grote bron verschuivingen. Hierdoor beweegt de lichtbron alleen met 50-100 urn voldoende subpixel verschuivingen op de detector vlak, waardoor ongewenste variaties in i) verlichting richting / perspectief een bereikennd ii) de effectieve sample-to-sensor afstand op elke bron positie. Als dat niet voorkomen, kunnen deze verschillen leiden tot grote afwijkingen in de pixel super-opgelost beelden. Daarom kan de hologrammen opgenomen in elke bronpositie op een bepaalde hoek, daadwerkelijk beschouwd deelelement verschoven versies van hetzelfde holografische afbeelding. Bovendien zijn de bijna uitlijning vrij ontwerp van lensfree optische tomografie maakt het vrij eenvoudig om de projectie hologrammen op te nemen in verschillende hoeken, simpelweg door het draaien van een lichtbron 7,9, of het gebruik van meerdere lichtbronnen (zoals LED's) in verschillende hoeken 8.
LOT is een opkomende techniek die een grote ruimte-bandbreedte product voor on-chip beeldvorming van de monsters biedt. Belangrijk is, het is een schaalbare technologie die sterk zullen profiteren van de volgende generatie detector arrays. Dat wil zeggen, als sneller CMOS-en CCD-detector arrays met dichtere pixels beschikbaar zijn, LOT zal continumachines verbeteren, zowel in termen van resolutie, veld-of-view en snelheid. Dit is een belangrijk voordeel van lensfree on-chip microscopie ten opzichte van conventionele lichtmicroscopie, waar beeldkwaliteit wordt bepaald door meerdere sub-systemen, belemmeren de directe schaling van beeldkwaliteit met de vooruitgang in digitale technologieën.
In het kort, waardoor high-throughput 3D-microscopie van monsters over een groot beeldvorming volume, in een compacte architectuur, kan lensfree optische tomografie een nuttige toolset voor lab-on-a-chip systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Linear X-Y stages | Newport Corp. | MFA-PP | Miniature Linear Stage |
| Motorized rotation stage | Thorlabs | PRM1Z8 | Motorized Precision Rotation Mount |
| Multimode optical fiber | Thorlabs | AFS105/125Y | Multimode Fiber |
| Light source | Newport Corp. | 6255 | Ozone-free Xenon Lamp |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Cornerstone 260 1/4 m Monochromator |
| CMOS sensor array | Aptina Inc. | MT9P031STC | 5 Megapixels CMOS Sensor |
| C. elegans sample | Carolina Biosupply | 173500 | Wild-type C. elegans |
| Levamisole | Sigma Aldrich | L9756-5G | Tetramisole hydrochloride |
References
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009 (2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109 (2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
