Summary
השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.
Abstract
כדי להבין את תפקידו של גן בהתפתחות הדלקת במעי גס, השווה את התגובות של עכברי סוג פראי ועכברי נוקאאוט החסרים הגנטית של ריבית לקוליטיס. אם הגנים של האינטרס מתבטא בשני תאי מח עצם ותאי שמקורם נובעים מח עצם שאינם של המארח, עם זאת, ניתן להבחין את התפקיד של גן של עניין בתאי מח עצם ומקורם במח עצם שאינו תאים שהופקו על ידי טכניקת השתלת מח עצם. כדי לשנות את הגנוטיפ מח העצם נגזר תאים של עכברים, מח העצם המקורי של עכברי נמען נהרסו על ידי הקרנה ולאחר מכן הוחלף על ידי מח עצם מתורם החדש של גנוטיפ השונה. כאשר מח עצם פראי מסוג עכברי תורם הושתל בעכברי נוקאאוט, אנו יכולים לייצר עכברי נוקאאוט עם ביטוי גנים פראי מסוג תאים שמקורם במח עצם. לחלופין, כאשר מח עצם מתורם עכברי נוקאאוט הושתל בעכברי נמען סוג פראי, עכברי סוג פראי ללא גנים של האינטרס להביעממח עצם תאים שמקורם יוצרו. עם זאת, השתלת מח עצם לא יכולה להיות 100%. לכן, אנו מנוצלים מקבץ של בידול מולקולות (CD) (CD45.1 וCD45.2) כסמנים של תאי תורם ומקבל כדי לעקוב אחר שיעור תאי מח עצם מתורם נגזרים בעכברי נמען והצלחה של השתלת מח עצם. עכברי סוג פראי עם CD45.1 עכברי גנוטיפ ונוקאאוט עם גנוטיפ CD45.2 היו בשימוש. לאחר ההקרנה של עכברי נמען, את תאי מח העצם של תורם גנוטיפים שונים שהחדירו לתוך עכברי הנמען. כאשר מח העצם החדש מחדש להשתלט על חסינותה, העכברים היו לערער על ידי סוכן כימי (נתרן גופרתי dextran, DSS 5%) כדי לגרום לדלקת מעי גס. הנה גם אנחנו הראינו את השיטה כדי לגרום לדלקת המעי גס בעכברים ולהעריך את תפקידו של הגן של עניין הביע מתאי שמקורם של מח עצם. אם הגנים של האינטרס מהתאים שמקורם העצם ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות המחלה (כגון coliTIS), הפנוטיפ של עכברי נמען עם השתלת מח עצם ניתן לשנות באופן משמעותי. בתום ניסויי קוליטיס, מח העצם נגזר תאי דם ובמח עצם תויגו עם נוגדנים נגד CD45.1 וCD45.2 והיחס הכמותי שלהם לקיום יכול לשמש כדי להעריך את ההצלחה של השתלת מח עצם על ידי cytometry זרימה. השתלת מח עצם מוצלחת צריכה להראות רוב מכריע של גנוטיפ תורם (בטווח של מולקולת סמן תקליטור) על הגנוטיפ נמען הוא במח העצם והדם של עכברי נמען.
Protocol
1. לפני שאתה מתחיל, שיקולים טכניים
- אנו ממליצים להשתמש בשני עכברי C57/BL6 סוג פראי ועכברי נוקאאוט לניסוי כי עכברים עם מולקולות CD מתאימות ניתן לרכוש מיצרני העכברים גדולים.
- מכיוון שקשה לעקוב אחר עכברי הסוג פראי ועכברי נוקאאוט ליטול תאים תורמים לאחר השתלת מח עצם, יש צורך להשתמש CD45.1 עכברים לייצג עכברי סוג פראי. (CD45.1 מניית C57/SJL WT עכברי ג'קסון מעבדות # 002014).
- רוב מושבות עכבר הן CD45.2. עכברי נוקאאוט שייכים לCD45.2 גנוטיפ (CD45.2 מקור WT עכברים לחלופין: ג'קסון מעבדות מנייה # 000664). קביעת גנוטיפ CD45.1 או CD45.2 יכולה להתבצע באמצעות cytometry זרימה של מח עצם ודם היקפי כאמור בסעיף 7 בפרוטוקול זה.
- עכברים לאחר ההקרנה התפשרו חסינות. שמור עכברים במתקן חופשי הפתוגן.
- מבצע של irradiator דורש אבטחה המיוחדת clearancדואר והכשרה. כדי לחסוך זמן בתהליכי הכשרה ואישור, עדיף לשתף פעולה עם מעבדה עם טכנאי מוסמך שמסוגל לפעול irradiator.
- מוסדות רבים יש מעבדות cytometry זרימה עם טכנאים מנוסים. כדי למזער את בעיות עם ניתוח cytometry זרימה, עדיף לדון בתכנית ניסוי cytometry הזרימה שלך עם הטכנאי המנוסה לפני שאתם מתחילים.
- עכברים חולקו באופן זה (10 עכברים בכל קבוצה):
| קבוצה | תורם מח עצם לנמען | טיפול | |
| BM חילופים | CD45.1 WT לCD45.2 KO | DSS קוליטיס | |
| B | שליטת מים רגילה | ||
| ג | BM חילופים | CD45.2 KO לCD45.1 WT | DSS קוליטיס |
| D | שליטת מים רגילה | ||
| E | התחזות | CD45.1 WT לCD45.1 WT | DSS קוליטיס |
| F | שליטת מים רגילה | ||
| סול | התחזות | CD45.2 KO לCD45.2 KO | DSS קוליטיס |
| H | שליטת מים רגילה |
* המחשה קצרה של פרוטוקול ניסוי, מוצגת באיור 1.
2. הקרנת עכברי נמען
- עכברים הם התרבו והמשיכו במתקן לפתוגן חופשי. עכברים שמים בעוגת הקרנת autoclaved עם מסנן. הנח את עכבר אחד בכל חריץ של עוגת הקרנה. הנח את העוגה לirradiator ולוודא פטיפון והעוגה פונים.
- הפעל את משאבת האווירלאוורור. סגור את דלת irradiator ולנעול אותו.
- להקרין את העכברים עם 1000 ראד (שהוא שווה ערך ל 10 Gy) סביב 10 דקות (תלוי במקור קרינה וזמן מחצית חיים). מנקודת זמן זו, עכברים המוקרנים הם חיסוני נפגעים, והיו לו חסינות חלשה נגד זיהום. לאחר הקרנה, לקחת את העוגה ומניח במכל סטרילי לתחבורה לבטיחות ביולוגית קבינט במתקן בעלי חיים. הימנע מחשיפת העכברים לסביבה חיצונית כדי למזער את הסיכוי לזיהום.
- בbiosafety הממשלה, להעביר את העכברים בכלובי עכברי autoclaved עם מצעי autoclaved (4 עכברים לכלוב הוסיפו מים סטריליים חדשים עם השעית sulfatrim -. 3.12 מ"ל למיליליטר מים 100).
- לעטוף את בקבוק המים עם רדיד אלומיניום כאנטיביוטיקה היא רגישה לאור. Shake לערבב את בקבוק פתרון sulfatrim גם לפני טעינתו לכלוב.
3. חילוץ תורם מח עצם
- להקריב את עכברים עם דו תחמוצת הפחמן או isoflurאהה ואז לטבול בתמיסה 1:200 לנזול. לרסס את העכברים עם אתנול 70% כדי להרטיב את העור ועצמות לנתח פתוחות.
- משרה את מכשירי הנתיחה באתנול 70% לעיקור.
- לבצע נתיחה בארון בטיחות ביולוגי. ישתמש בכלים סטריליים הנתיחה לחשוף את עצם הזרוע, עצם הירך, השוקה ועצמות שוקית, חופשי מצירוף שרירים ורצועות.
- חתך פתוח בשני הקצוות של עצמות להראות מח העצם האדום. החזק את עצמותיו במלקחיים. שטוף את מח העצם האדום עם PBS הקר עם מזרק 3 מ"ל ומחטי 25G לצלחת פטרי. לשטוף משני קצות עצמות להניב תאי מח עצם יותר.
- השתמש 6 מיליליטר מזרקים ו18G1 / 2 מחטים לשבור תקעי מח עצם אדומים בשאיפה ופליטה חוזרות ונשנים. העברת מח עצם עם 50 צינורות מ"ל פלקון.
- ספין מח העצם למטה ב1800 סל"ד למשך 5 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant, resuspend גלולה ידי vortexing לשניות 5-10.
- דלל חיץ תמוגה RBC 10X עם מים סטריליים. מודעהד 1X RBC תמוגה החיץ (5 מ"ל לעכבר תורם), מערבולת שוב למשך 5 שניות ולהמשיך בדיוק 3 דקות בטמפרטורת חדר.
- לאחר 3 דקות, למלא את הצינורות עם 20 המ"ל PBS הקר כדי לעצור את תמוגה ומערבבת. יוצק את התוכן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ישירות לתוך צינור חדש 50 מ"ל פלקון.
- יש לשטוף את הצינורות המקוריים עם 5 מ"ל של PBS ויעביר למסננת תא גם כן. למעלה עד 50 מ"ל עם PBS ומערבב.
4. ספירת תאי תורם מח עצם
- הוסף 100 μl של Trypan כחול לצינור אפנדורף ו100 μl של השעית מח עצם לצינור ותמהיל אפנדורף. פיפטה את תערובת התא המוכתמת לhemocytometer.
- כמות התאים מחושבת על ידי ספירה כוללת חי מח עצם תא בצינורות פלקון = מספר תא כתם ב16 ריבועים x 2 (בשל דילול הכחול Trypan) x 10000 x 50 מ"ל
- ספין למטה תאי מח העצם ב50 צינורות מ"ל פלקון ב2000 סל"ד למשך 5 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant. מבוססעל ספירת התאים כלל, resuspend הגלולה עם PBS ל1 x 10 8 תאים למ"ל
5. עירוי לעכברי נמען
- לחמם את עכברי הנמען בפנקס חום ותחת מנורת חימום. לשים את עכברי נמען בעוצר. להזריק 1 x 10 7 תאים לכל עכבר ב100-200 μl דרך וריד.
- הזרקה של מח עצם מתורם יש לעשות בין 4-24 שעות לאחר הקרנה.
- שמור עד 4 עכברים שהוזרקו לכלוב. לשמור על עכברי הנמען הזריקו בכלובי autoclaved במי אנטיביוטיקת מטופלים-במשך 4 השבועות הראשונים במתקן בעלי חיים חופשי הפתוגן ולאפשר לעכברים להחזיר חסינות. כלובים לשנות את מים, שטופל באנטיביוטיקה ואוכל כל 4 ימים כדי לשמור על היגיינה.
6. אינדוקציה של קוליטיס והערכה של קוליטיס
- 4 שבועות לאחר השתלת מח עצם וקרינה, לעבור למים רגילים ללא אנטיביוטיקה ולשמור על עכברים עבור 2 שבועות נוספים כדי להחזיר אותם רגיליםבטן מיקרופלורה.
- 6 שבועות לאחר הזרקת מח עצם, למדוד משקל גוף ראשוני. יש עכברים מקבלים 5% סולפט dextran בשתיית מים כרצונך כדי לגרום לדלקת מעי גס. יש עכברים מקבלים מי שתייה רגילה רק כקבוצת ביקורת נורמלית.
- כעבור 5 ימים, לסגת דם היקפי, להעביר לצינורות מצופים הפרין (Vacutainer) ולשמור על קרח. ברכת הדם מגיל 4 עכברים לצינור 1. שלב 300 μl דם עם 300 μl של חיץ מכתים תא = 600 μl. לחלק את הדם ל5 צינורות Eppendorf, כל אחד עם 100 μl.
- להקריב את העכברים עם דו תחמוצת הפחמן או isoflurane. הערכת ציוני ניזקים מקרוסקופיים (נא עיין בפרסום אחר יופיטר וידאו לפרטי 1). למדוד שינוי במשקל גוף. אורך מעי מידה ועובי עם קליפר הדיגיטלי. שים לב מרקם צואה (קשה, רך או בכלל). קבע דם סמוי בצואה עם Hemooccult. לנתח רקמות מעי גס ולתקן בפורמלין עבור H & E מכתימה.
- לנתח 1 הירך boנה לעכבר, לחלץ מח עצם ולשטוף את מוח העצם בקור PBS באמצעות מחט 25G ומזרק 1 מ"ל. 4 מח עצם ברכה מתחבר לצינור 1 ולשמור על קרח.
- יוצק את מח העצם לצלחת פטרי, גזירת תוספת מח העצם עם מחט 18G ו5 מיליליטר מזרקים מספר פעמים עד שלא תקע מח עצם הוא הווה.
- ספין למטה עם 1,500 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסרת supernatant ו resuspend תא עם חיץ מכתים μl 600. מחלק את מח עצם resuspended ל 5 צינורות Eppendorf, כל אחד עם 100 μl.
7. איכות פיקוח של השתלת מח עצם על ידי זרימת cytometry
- כל תווית דוגמיות של דם או # 1-5 מח עצם:
- מכין את תערובת נוגדנים לכל צינור מתאים בחושך.
# 1 אין נוגדן
# 2 שליטת אלוטיפ FITC μl 30 + 30 μl PE אלוטיפ בקרה + 15 CD16/32 חסימת μl
# 3 30 FITC μl CD45.1 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl
# 4 30 PE μlCD45.2 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl
# 5 30 FITC μl CD45.1 Ab + 30 μl PE CD45.2 Ab + 15 CD16/32 חסימת μl
| תוסיף דבר לדם או # 1 דגימת מוח עצם |
| הוסף 5 μl של תערובת נוגדנים # 2 לכל דם או # 2 דגימת מוח עצם |
| הוסף 3 μl של תערובת נוגדני # 3 לכל דם או # 3 דגימת מוח עצם |
| הוסף 3 μl של תערובת נוגדנים # 4 לכל דם או # 4 דגימת מוח עצם |
| הוסף 5 μl של תערובת נוגדנים # 5 לכל דם או # 5 דגימת מוח עצם |
- שמור בחושך בקרח למשך 30 דקות.
- הוסף 2 מיליליטר חיץ 1X RBC תמוגה לכל צינור. לשמור בסוד על קרח במשך 15 דקות.
- ספין למטה התאים ב 1500 סל"ד, 5 דקות ב 4 ° C. (3.8 הרוטור GH, 1500 סל"ד = 350 XG) הסרת supernatant. Resuspend הגלולה עם חיץ 500 μl תא מכתים בזמן הקצר הכהה, אז המערבולת. בדקו CD45.1 (המייצג WT) וCD45.2 (המייצג KO) בדם immunostained ודגימות מח עצם על ידי cytometry זרימה. בחר FITC לייצג WT CD45.1 וPE לייצג KO CD45.2.
- לנתח את תוצאות cytometry הזרימה באמצעות תוכנת FlowJo. חישוב יחס FITC: PE יחס או PE: יחס FITC כדי לקבוע אם גנוטיפ התורם גנוטיפ הדומיננטי בדם ומוח עצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם הגנים של האינטרס ממלא תפקיד משמעותי בתאי מערכת חיסוניים במהלך פיתוח של קוליטיס, העכברים שקבלו מח עצם של גנוטיפ השונה באמצעות השתלת מח עצם (WT לKO KO או לWT) צריך להיות תגובה שינתה לקוליטיס DSS. אחד הפרמטרים החשובים ביותר לקביעת החומרה של קוליטיס היא צביעת H & E של רקמות המעי הגסות. שינויים גסי רקמות מבנה וסימנים של דלקת ניתן להעריך כמותית ידי שיטת ניקוד E היסטולוגיה H &. קריטריונים עבור H & E ניקוד היסטולוגיה למודל קוליטיס DSS יכולים למצוא כאן 2. לחלופין, קוליטיס המושרה הכימי יכול גם להיגרם על ידי trinitrobenzene חומצת sulfonic (TNBS). שיטות של אינדוקצית קוליטיס TNBS וקריטריוני בקיע היסטולוגיה H & E ניתן למצוא בפרסום קודם 3. הבדל ניקוד היסטולוגיה בין קבוצות יכול להיות מנותח על ידי תלמידו של מבחני t.
העכברים עלולים להיות משמעותייםלהשתפר או החמיר קוליטיס בהשוואה לעכברים עם דמה השתלת מח עצם (WT לWT או KO לKO). אם הגנים של האינטרס משחק תפקיד משמעותי בקוליטיס באמצעות תאים שמקורם במח עצם, בעכברים עם מח עצם החליף צריכות להגיב שונים באופן משמעותי מהעכברים עם השתלת מח עצם אחיזת עיניים.
עבור דגם קוליטיס DSS, שינוי היסטולוגיה יכול להיות מוערך על ידי ניקוד היסטולוגיה (ראה איור 4). שינוי משמעותי של ציון היסטולוגיה עשוי להצביע על ההתפתחות של קוליטיס מתווכת על ידי הגנים של האינטרס בתאים שמקורם במח עצם. לדוגמה, cathelicidin הוא גן פפטיד אנטי מיקרוביאלי ואנטי דלקתי (גנים של עניין במקרה שלנו) 4. בלי השתלת מוח עצם, עכברי KO cathelicidin בדרך פתחו קוליטיס הגרוע מעכברים פראיים מסוג שעשו בתגובה לDSS. עירוי של מח פראי מסוג (WT) עצם נוקאאוט cathelicidin (KO) עכברים מוביל לקוליטיס טויב תוך transfusi במח עצם מנוקאאוט cathelicidin (KO) עכברים לעכברים פראיים מסוג-(WT) מוביל לקוליטיס החמיר כאשר נחשף לDSS (איור 2).
כדי לאמת את הביטוי של גנים של אינטרס, ביטוי mRNA של גנים של אינטרס (לדוגמה. Cathelicidin) ממח עצם פראי מסוג התורם צריך להתגלות ברקמות המעי הגסות (או אחר) של עכברי נמען cathelicidin הלקויים נוקאאוט אחרי העצם השתלת מח. המעניין גם לדעת אם הביטוי של גנים של אינטרס בעכברי נמען סוג פראי מצטמצם לאחר תרומה של מח עצם עכברי נוקאאוט.
engraftment המוצלח של מח עצם מתורם מיוצג על ידי יחס דומיננטי של אלוטיפ תקליטור התורם מעל אלוטיפ נמען התקליטור הוא בתאי דם היקפיים ומח עצם של עכברי נמען. מח עצם מראה טוב ביותר תיוג של CD45.1 וCD45.2 cytometry זרימת דם כיש הרבה תאי בתוליים (איור 2 ו 3).
"Jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. פרוטוקול הניסוי של השתלת מח עצם.
איור 2. נתוני cytometry זרימה של מוח עצם של עכברי נמען לאחר השתלת מח עצם. ציר Y מציג FITC שכותרת CD45.1 האות וציר ה-X מראה PE-כותרת CD45.2 אות. השתלת עצם מוצלחת מוגדרת על ידי השינוי של גנוטיפ CD45.1 או CD45.2 בשניהם מח עצם ודם של עכברי נמענים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
o: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 3. נתוני cytometry זרימת הדם של עכברי נמען לאחר השתלת מח עצם. ציר Y מציג FITC שכותרת CD45.1 האות וציר ה-X מראה PE-כותרת CD45.2 אות. השתלת עצם מוצלחת מוגדרת על ידי השינוי של גנוטיפ CD45.1 או CD45.2 בשניהם מח עצם ודם של עכברי נמענים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. הערכה של קוליטיס בעכברים לאחר השתלת מח עצם. () המדגם H & E תמונות של נקודותיים עם normal היסטולוגיה וDSS קוליטיס. (ב) ציוני היסטולוגיה. אינדוקציה מוצלחת של קוליטיס DSS יכולה להיות מאושרת על ידי גידול משמעותי של ציון היסטולוגיה ביום 5 לטיפול DSS. לאחר חילופי מח עצם לגנוטיפ השונה, ציון היסטולוגיה צריך לשנות באופן משמעותי. הדבר מצביע כמובן שינה של קוליטיס בגנים של האינטרס לבטא בתאים שמקורם במח העצם. מידע מיוצג על ידי ± שגיאה סטנדרטית ממוצעת של אמצעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גישת השתלת מח עצם זה מתאים למחקר אימונולוגיה של דלקת מעי גס, זיהום, סרטן, השמנת יתר ומחלות אחרות. ניסוי השתלת מח עצם זה נחוץ כאשר הגנים של האינטרס מתבטא הוא במח העצם נגזר ותאים שאינם מח עצם נגזרות וגנים של האינטרס הוא חשוד לתווך מחלה על ידי תאים מאו אוכלוסייה. לדוגמה, מיקרוביאלית פפטיד cathelicidin מוצג לווסת קוליטיס האקוטי. אבל זה בא לידי הביטוי בשני תאי האפיתל ותאי מערכת חיסון (כגון מקרופאגים). ואז השתמשנו בהשתלת עצם כדי להגדיר אילו אוכלוסייה של תאי מודולציה קוליטיס החריף בעכברים. חומרת קוליטיס השתנתה באופן משמעותי לאחר השינוי של גנוטיפים cathelicidin מח עצם באמצעות השתלת מח עצם. ואז אנו יכולים להסיק cathelicidin שמתבטא בתאים שמקורם במח עצם ממלא תפקיד משמעותי בויסות קוליטיס החריף בתגובה לDSS.
העצם marrow תאים שמקורם בדרך כלל כוללים תאי דם אדומים, כדוריות דם לבן וטסיות דם. השתלת מח עצם משנה את הגנוטיפ של תאים אלה אך לא לאחרים. רוחבי מדבר, הניסוי הזה יכול להבדיל את התפקיד של גנים של אינטרס בתאים שמקורם במח עצם לעומת תאים שמקורם במח עצם שאינו יחיד. אבל הניסוי הזה לא יכול להגדיר איזו אוכלוסייה של מח עצם נגזר מתווך תאי קוליטיס כמו כל תאי הדם האדומים, כדוריות דם לבן וטסיות נגזרים ממח עצם. גורלם של תאים שמקורם במח עצם הגרו לנקודותיים במהלך קוליטיס הוא אזור פעיל ושנוי במחלוקת של מחקר. לאחר השתלה ואינדוקציה של קוליטיס העכברי מח עצם, סביר להניח שחלק מתאי שמקורם במח עצם קיים כתאים וmyofibroblasts הלימפה בנקודותיים 5. דו"ח אחר הראה כי תאים במח עצם הנגזרים משמשים כתאים אנדותל לneovascularization בתהליך ההחלמה של 6. יש גם evidencתאי דואר מראים מח עצם נגזרים קשורים התמיינות תאים אפיתל בחולים עם 7 קוליטיס. אנחנו לא יכולים להוציא מכלל האפשרות שחלק מתאי שמקורם במח עצם יכול להבדיל לתאים אחרים מאשר תאי מערכת חיסון טיפוסיים וממלא תפקידים בויסות התפתחות קוליטיס. אוכלוסייה למרות זאת, נגזר מח העצם monocyte / מקרופאג חשובה להגנה מפני ניזק כימי מושרה מעי רירי 8,9. דו"ח זה עולה בקנה אחד עם ממצאינו שcathelicidin הביע מתאי שמקורם במח עצם מודולציה קוליטיס DSS תוך cathelicidin מופרש ממונוציטים / מקרופגים 4.
מצד השני, יש דרכים רבות כדי לעקוב אחר ההצלחה של השתלת מח עצם. ניתוח cytometry הזרימה של CD45.1 וCD45.2 גנוטיפים יכול לספק שיטה כמותית לקביעת שיעור תאי תורם מח עצם בתאי גזע שמקורם בעכברי הנמען. מח עצם נגזר תאזה יכול להתמיין לסוגים שונים של תאים 10. כאשר ניתוח cytometry זרימה אינו אפשרי, ניתן להשתמש (כרומוזום XY) עכברי זכרים ותורמים (כרומוזום XX) עכברי נמען נשי 11. העכברים התורמים ישאו כרומוזומי Y ייחודי בגוף XX עכברי נמען נקבות בלבד. כרומוזום Y ניתן לזהות על ידי ניאון כלאה באתר 11. בנוסף, אימונוהיסטוכימיה של CD45.1, CD45.2 ו / או הגנטי של האינטרס ברקמות עשויה להיות נחוצה כדי להמחיש את תאי תורם מח עצם נגזרות.
אבל ניתוח CD45 זרימה cytometry וכרומוזום Y בהליכי כלאה באתר נעשים בדרך כלל לאחר שהעכברים הוקרבו. כדי לעקוב אחר מיקומו של תורם בתאים בעכברי הנמען בשימוש ללמוד מחלות כרוניות כמו סרטן, מבלי להקריב את העכברים, ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוקים כמו עכברים תורמים 12. לכן, עצם מתורם לפגוםתאי שורה נגזרת יכולים להיות במעקב בגוף של עכברי הנמען תחת הדמיה ברזולוציה אופטית גבוהה לא פולשנית תחת הרדמה חולפת וניתן לעשות זאת שוב ושוב.
לא כל העכברים יש השתלת מח עצם מוצלח 13. אנו הבחנו ~ 10-20% מעכברים מתים ב2 השבועות הראשונים לאחר הקרנה עקב אנמיה או זיהום. לכן, יותר עכברים מדרוש צריכים להיות מוכנים בתחילת הניסוי. לדוגמה, אתה צריך להכין 10 עכברים לכל קבוצה בתחילת הניסוי, אם אתה מצפה 8 עכברים בכל קבוצה זמינה בסוף ניסוי קוליטיס. כמו כן, ודא שתסיר את העכברים המתים בהקדם האפשרי. המהירות של כינון מחדש חיסוני מתואמת למספר לתאי גזע hematopoietic במח העצם החדיר לתוך עכברי הנמען 14. לכן, חיוני שיהיה מספר מספיק של תאי חי מח עצם (1 10 7 x תאים לכל עכבר) החדורים לעכברי נמען לtr מח העצם המוצלחansplantation.
עכברי נמען לאחר ההקרנה התפשרו חסינות. נתיחת עכברי תורם ונהלי הכנת מח עצם צריך להיעשות באותה הרמה כמו ניסויי תרביות תאים. שימוש במכשירים ומיכלים סטריליים, טכניקות טיפול אספטיים צריכות להיות מיושמים. לאורך כל הניסויים, PBS מכיל 1% פניצילין וסטרפטומיצין הפרין 10 U / ml יש להשתמש במהלך הטיפול בקישוא בעצמות. כל המגיבים הם כיתת תרבית תאים. דיון טכני נוסף ניתן למצוא בהתייחסות 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק פיילוט ובדיקת היתכנות מאוניברסיטת UCLA-CURE מרכז, קרוהן וקוליטיס קרן פרס אמריקה פיתוח קריירה (# 2691) והמכון הלאומי לבריאות NIDDK K01 (DK084256) מימון לכב וואי Koon של.
פעולת הקרנת מח העצם נעזרה בברנרד לוין ומטבח סקוט של UCLA מרכז לחקר איידס עכבר / מתקן Core כימרה אנושי. פעולת זרימת cytometry נעזרה במתקן Core וקטור-UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
