Summary
Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.
Abstract
Om de rol van een gen in de ontwikkeling van colitis begrijpen, vergeleken we de reactie van wild-type muizen en gen-van-belang deficiënte knockout muizen colitis. Als het gen-van-belang wordt uitgedrukt in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen van de gastheer, maar is het mogelijk om de rol van een gen van belang onderscheid in van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen door beenmergtransplantatie techniek. Het beenmerg afgeleide cellen genotype muizen veranderen, werden de oorspronkelijke beenmerg van ontvangende muizen vernietigd door bestraling en vervangen door nieuwe donor beenmerg van verschillende genotype. Wanneer wild-type muizen donor beenmerg getransplanteerd knockout muizen, kunnen we genereren knockout muizen met wild-type genexpressie in van beenmerg afgeleide cellen. Als alternatief werd toen knockout muizen donor beenmerg getransplanteerd naar wild-type ontvangende muizen, wild-type muizen zonder gen-van-een blijk van belangstellingvan beenmerg afgeleide cellen geproduceerd. Kan echter beenmergtransplantatie niet 100% volledig zijn. Daarom gebruikten we cluster van differentiatie (CD) moleculen (CD45.1 en CD45.2) als markers van donor en ontvangende cellen het percentage van donor beenmerg afgeleide cellen in de ontvangende muizen en succesvolle beenmergtransplantatie volgen. Wild-type muizen met CD45.1 genotype en knockout muizen met CD45.2 genotype werden gebruikt. Na bestraling van ontvangende muizen werden de donor beenmergcellen van verschillende genotypen ingebracht in de ontvangende muizen. Wanneer de nieuwe beenmerg geregenereerde over te nemen immuniteit, werden de muizen uitgedaagd door chemisch middel (dextran natriumsulfaat, DSS 5%) colitis te induceren. Hier bleek ook de methode colitis te induceren in muizen en evalueren van de rol van het gen van interesse tot expressie gebracht uit beenmerg afgeleide cellen. Als het gen-van-belang van het bot afgeleide cellen speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de ziekte (zoals colitis), kan het fenotype van de ontvangende muizen met beenmergtransplantatie aanzienlijk worden gewijzigd. Eind colitis experimenten, het beenmerg afgeleide cellen in bloed en beenmerg werden gemerkt met antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 en de kwantitatieve verhouding bestaan kunnen worden gebruikt om het succes van beenmergtransplantatie door flowcytometrie evalueren. Succesvolle beenmergtransplantatie moeten tonen een grote meerderheid van de donor genotype (in termen van CD molecule marker) over de ontvanger genotype in zowel het beenmerg en het bloed van de ontvanger muizen.
Protocol
1. Before-you-start Technische overwegingen
- Wij raden u aan zowel C57/BL6 wild-type muizen en knock-out muizen voor experiment, omdat muizen met bijbehorende cd-moleculen kunnen worden gekocht bij de grote muis leveranciers.
- Aangezien het moeilijk op te sporen het wild-type muizen en knockout muizen afgeleide donorcellen na beenmergtransplantatie, moet CD45.1 muizen gebruiken om wild-type muizen vertegenwoordigen. (CD45.1 C57/SJL WT muizen Jackson Laboratories voorraad # 002014).
- De meeste muizen kolonies zijn CD45.2. Onze knockout muizen behoren tot CD45.2 genotype (als alternatief een CD45.2 WT muizen bron: Jackson Laboratories voorraad # 000664). De bepaling van CD45.1 of CD45.2 genotype kan worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie van beenmerg en perifeer bloed als bedoeld in hoofdstuk 7 van dit protocol.
- Muizen na bestraling hebben stoornissen van het immuunsysteem. Houd muizen in pathogeenvrije faciliteit.
- Werking van bestraler vereist speciale beveiliging clearance en training. Om tijd te besparen in de opleiding en goedkeuringsprocessen, is het het beste om samen te werken met een laboratorium met gekwalificeerde technicus die in staat is om de bestraler bedienen.
- Veel instellingen hebben flowcytometrie laboratoria met ervaren technici. Het minimaliseren van problemen met flowcytometrie werking, is het beter om uw flowcytometrie experiment plannen te bespreken met de ervaren technicus voordat u begint.
- Muizen kregen op deze wijze (10 muizen per groep):
| Groep | Beenmerg donor tot ontvanger | Behandeling | |
| Een | BM-uitwisseling | CD45.1 WT te CD45.2 KO | DSS colitis |
| B | Water normale controle | ||
| C | BM-uitwisseling | CD45.2 KO te CD45.1 WT | DSS colitis |
| D | Water normale controle | ||
| E | Schijn | CD45.1 WT te CD45.1 WT | DSS colitis |
| F | Water normale controle | ||
| G | Schijn | CD45.2 KO te CD45.2 KO | DSS colitis |
| H | Water normale controle |
* Een korte illustratie van experimentele protocol wordt weergegeven in figuur 1.
2. Ontvangende muizen Bestraling
- Muizen gefokt en gehouden in pathogeenvrije faciliteit. Plaats muizen in geautoclaveerd bestraling taart met filter. Plaats een muis in elke sleuf van bestraling taart. Plaats de taart in de bestraler en zorg ervoor dat de draaitafel en taart draaien.
- Zet de luchtpompvoor ventilatie. Sluit de bestraler deur en vergrendel deze.
- Bestralen de muizen met 1000 rad (wat overeenkomt met 10 Gy) ongeveer 10 min (afhankelijk van stralingsbron en halfwaardetijd). Vanaf dit tijdstip werd de bestraalde muizen immuno-gecompromitteerde en zwak immuniteit tegen infectie. Na bestraling, neemt u de taart buiten en plaats in een steriele container voor het transport van de bioveiligheid kast in dierlijke faciliteit. Vermijd blootstelling van de muizen om externe omgeving om de kans op besmetting te minimaliseren.
- In bioveiligheid kabinet, de overdracht van de muizen in de autoclaaf muizen kooien met geautoclaveerd beddengoed (4 muizen per kooi nieuw steriel water toevoegen met sulfatrim vering -. 3,12 ml per 100 ml water).
- Wikkel de waterfles met aluminiumfolie als de antibiotica zijn lichtgevoelig. Schud de sulfatrim flesje goed te mengen voordat u het aan de kooi.
3. Donor beenmerg Extractie
- Offeren muizen met kooldioxide of isoflurAnce en dan onderdompelen in 1:200 Lysol oplossing. Spuit de muizen met 70% ethanol om de huid vochtig en open botten ontleden.
- Week de dissectie-instrumenten in 70% ethanol voor sterilisatie.
- Voer de dissectie in een bioveiligheid kast. Gebruik de steriele dissectie-instrumenten aan de humerus, dijbeen, scheenbeen en kuitbeen botten, vrij van hechten spieren en ligamenten bloot te leggen.
- Knip de beide uiteinden van de botten van de rode beenmerg te tonen. Houd de botten met een pincet. Spoel de rode beenmerg uit met koude PBS met 3 ml spuit en 25G naalden om een petrischaal. Spoelen van beide uiteinden van botten meer beenmergcellen leveren.
- Gebruik 6 ml spuiten en 18G1 / 2 naalden in rood beenmerg stekkers te doorbreken door herhaalde aspiratie en uitwerpen. Overdracht beenmerg met 50 ml Falcon buizen.
- Draai het beenmerg van 1800 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi supernatant, resuspendeer pellet door vortexen gedurende 5-10 sec.
- Verdun 10X RBC lysis-buffer met steriel water. Advertentied 1X RBC lysis buffer (5 ml per donor muis), vortex opnieuw 5 sec en houdt exact 3 min bij kamertemperatuur.
- Na 3 min, vul de buizen met 20 ml koude PBS tot de lysis en meng stoppen. Giet de inhoud door middel van een 40 um cel zeef direct in een nieuwe 50 ml Falcon buis.
- Spoel de originele verpakking met 5 ml PBS en transfer naar celzeef ook. Vul tot 50 ml met PBS en meng.
4. Tellen Bone Marrow Donor cellen
- Voeg 100 ul van Trypan blauwe een Eppendorf buis en 100 ui beenmerg suspensie aan een Eppendorf buis en meng. Pipetteer de gekleurde cel mengsel in een hemocytometer.
- De hoeveelheid cellen wordt berekend door de totale levende beenmerg cellen in de Falcon tubes = unstained celaantal in 16 vierkanten x 2 (door Trypan blauwe verdunning) x 10.000 x 50 ml
- Spin down beenmergcellen in 50 ml Falcon buizen bij 2.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant. Op basisop het totale celtellingen, resuspendeer de pellet met PBS tot 1 x 10 8 cellen per ml
5. Infusie om ontvangende muizen
- Verwarm de ontvangende muizen op een warmte-pad en onder een warming lamp. Zet de ontvangende muizen in restrainer. Injecteer 1 x 10 7 cellen per muis in 100-200 pi intraveneus.
- Injectie van donor beenmerg gedaan moet worden tussen 4 tot 24 uur na de bestraling.
- Blijf op de 4 geïnjecteerde muizen per kooi. Handhaving van de geïnjecteerde ontvangende muizen in geautoclaveerd kooien met antibiotica behandeld water voor de eerste 4 weken in pathogeenvrije dieren faciliteit en laat de muizen weer immuniteit. Change kooien, antibiotica behandeld water en voedsel om de 4 dagen aan hygiëne.
6. Inductie van Colitis en evaluatie van colitis
- 4 weken na bestraling en beenmergtransplantatie, naar normaal water zonder antibiotica en handhaven de muizen gedurende 2 weken te hun normale herwinnengut microflora.
- 6 weken na beenmerg injectie meten oorspronkelijke lichaamsgewicht. Sommige muizen worden gegeven 5% dextransulfaat in drinkwater ad libitum aan colitis veroorzaken. Sommige muizen worden gegeven regelmatig drinken alleen water als normaal controlegroepen.
- 5 dagen later, terug te trekken uit perifeer bloed, over te dragen aan heparine gecoate buizen (Vacutainer) en houd in ijs. Zwembad het bloed van 4 muizen tot 1 tube. Combineer 300 ul bloed met 300 ui buffer cel kleuring = 600 pi. Verdeel het bloed 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl.
- Offeren muizen met kooldioxide of isofluraan. Evalueer macroscopische schade scores (zie andere JOVE video publicatie voor details 1). Meet lichaamsgewicht verandering. Meet darm lengte en dikte met digitale schuifmaat. Let op kruk textuur (hard, zacht of bloederig). Bepaal occult bloed in de ontlasting met Hemooccult. Ontleden colon weefsels en vast te stellen in formaline voor H & E kleuring.
- Prepareer een dijbeen bone per muis, uitpakken beenmerg en spoel het beenmerg met koude PBS via 25G naald en 1 ml spuit. Pool 4 beenmerg stekkers aan 1 tube en houdt in ijs.
- Giet het beenmerg om petrischaal, afschuiving het beenmerg stekker met 18G naald en 5 ml spuit meerdere keren tot er geen beenmerg stekker aanwezig is.
- Spin down met 1500 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer met 600 ul cel verkleuring buffer. Verdeel de geresuspendeerde beenmerg 5 Eppendorf buizen, elk met 100 pl.
7. Kwaliteitscontrole van beenmergtransplantatie door flowcytometrie
- Label elk monster buisjes bloed of beenmerg # 1-5:
- Bereid het antilichaam mengsel elke respectieve buis in het donker.
# 1 Geen antilichaam
# 2 30 ul FITC isotype controle + 30 pi PE isotype controle + 15 pl CD16/32 blokkeren
# 3 30 ul FITC Ab CD45.1 + 15 pl CD16/32 blokkeren
# 4 30 pi PECD45.2 Ab + 15 pi CD16/32 blokkeren
# 5 30 ul FITC Ab CD45.1 + 30 pi PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blokkeren
| Voeg niets aan bloed of beenmerg monster # 1 |
| Voeg 5 ul antilichaam mengsel # 2 voor elk bloed of beenmerg monster # 2 |
| Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 3 bij elk bloed of beenmerg monster nr.3 |
| Voeg 3 pl antilichaam mengsel # 4 voor de bloed of beenmerg monster nr.4 |
| Voeg 5 ul antilichaam mengsel nr.5 elk bloed of beenmerg monster # 5 |
- Houd donker ijs gedurende 30 minuten.
- Voeg 2 ml 1X RBC lysis buffer aan elke buis. Houd in donkere op ijs gedurende 15 minuten.
- Draai de cellen bij 1500 rpm, 5 min bij 4 ° C. (GH 3,8 rotor, 1.500 tpm = 350 xg) Verwijder supernatant. Resuspendeer de pellet met 500 ul cel verkleuring buffer in het donker, dan vortex kort. Controleer de CD45.1 (die WT) en CD45.2 (vertegenwoordiger van KO) in de immuun-gekleurd bloed en het beenmerg monsters door flowcytometrie. FITC selecteren om WT CD45.1 en PE vormen voor KO CD45.2 vertegenwoordigen.
- Analyseer de resultaten van flowcytometrie FlowJo software. Bereken de verhouding van FITC: PE ratio of PE: FITC verhouding te bepalen of donor genotype dominant genotype in bloed en beenmerg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als het gen-van-belang speelt een belangrijke rol in het immuunsysteem cellen tijdens de ontwikkeling van colitis, de muizen die beenmerg van verschillende genotype door beenmergtransplantatie (WT KO KO of om WT) moet een veranderde reactie op DSS colitis. Een van de belangrijkste parameters voor het bepalen van de ernst van colitis is de H & E kleuring van de colon weefsel. Colonic weefselstructuur veranderingen en tekenen van ontsteking kan kwantitatief worden geëvalueerd door H & E histologie scoresysteem. Criteria voor H & E histologische score voor DSS colitis model is hier 2 gevonden. Als alternatief kan chemische geïnduceerde colitis ook worden geïnduceerd door trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS). Methoden van TNBS colitis inductie en H & E histologische score criteria is te vinden in een eerdere publicatie 3. Histologiescore verschil tussen de groepen kunnen worden geanalyseerd door student t-tests.
De muizen aanzienlijk zijnverbeterd of verslechterd in vergelijking met colitis muizen met sham beenmergtransplantatie (WT WT of KO KO). Als het gen-van-belang speelt een belangrijke rol in colitis via beenmerg afgeleide cellen moeten de muizen met uitgewisselde beenmerg reageren significant verschillend van de muizen met sham beenmergtransplantatie.
DSS colitis model kan histologie verandering geëvalueerd door histologische scores (zie figuur 4). Significante verandering van histologiescore kan wijzen op de ontwikkeling van colitis gemedieerd door het gen-van-belang in van beenmerg afgeleide cellen. Bijvoorbeeld cathelicidine een anti-microbiële en anti-inflammatoire peptide gen (gen-van-belang in ons geval) 4. Zonder beenmergtransplantatie, cathelicidine KO muizen algemeen ontwikkeld slechter colitis dan wild-type muizen werden in reactie op DSS. Transfusie van wild-type (WT) beenmerg cathelicidine knockout (KO) muizen leidt tot verbeterd colitis terwijl transfusieen van beenmerg van cathelicidine knockout (KO) muizen wild-type (WT) muizen leidt tot verslechterde colitis bij blootstelling aan DSS (figuur 2).
Om expressie van gen-of-interest verifiëren moet de mRNA expressie van gen-of-interest (bijv.. Cathelicidine) van donor wild-type beenmerg detecteerbaar zijn in het colon (of andere) weefsels van het cathelicidine deficiënte knockout ontvangende muizen na bot beenmergtransplantatie. Het is ook interessant om te weten of de expressie van gen-van-belang in wild-type ontvangende muizen wordt verminderd na de donatie van knock-out muizen beenmerg.
Succesvolle implantatie van donor beenmerg wordt vertegenwoordigd door dominant verhouding donor CD CD ontvanger isotype meer isotype in zowel perifeer bloed en beenmerg van ontvangende muizen. Beenmerg toont best etikettering van CD45.1 en CD45.2 in flowcytometrie als bloed veel ongekleurde cellen (Figuur 2 en 3).
Figuur 1. Het experimentele protocol van beenmergtransplantatie.
Figuur 2. Flowcytometrie data van beenmerg van ontvangende muizen na beenmergtransplantatie. De Y-as toont FITC-gemerkte CD45.1 signaal X-as toont PE-gelabelde CD45.2 signaal. Succesvolle bot transplantatie wordt bepaald door de verandering van CD45.1 of CD45.2 genotype in zowel beenmerg en het bloed van de ontvangende muizen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Flowcytometrie data van bloed van ontvangende muizen na beenmergtransplantatie. De Y-as toont FITC-gemerkte CD45.1 signaal X-as toont PE-gelabelde CD45.2 signaal. Succesvolle bot transplantatie wordt bepaald door de verandering van CD45.1 of CD45.2 genotype in zowel beenmerg en het bloed van de ontvangende muizen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Evaluatie van colitis bij muizen na beenmergtransplantatie. (A) Sample H & E beelden van colons met normale histologie en DSS colitis. (B) Histologie scores. Succesvolle inductie van DSS colitis kan worden bevestigd door aanzienlijke verhoging van histologiescore van dag 5 van DSS-behandeling. Na het uitwisselen van beenmerg aan verschillende genotype, moet de histologie score significant veranderen. Dit suggereert dat veranderde tijdens colitis door het gen-van-belang tot expressie in het beenmerg afgeleide cellen. Gegevens worden vertegenwoordigd door gemiddelde ± standaardfout van middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze beenmergtransplantatie aanpak is geschikt voor immunologie van colitis, infecties, kanker, obesitas en andere aandoeningen. Dit experiment beenmergtransplantatie nodig wanneer het gen-van-belang wordt uitgedrukt in beide afgeleid beenmerg en niet-beenmerg afgeleide cellen en het gen-van-belang vermoedelijk ziekte bemiddelen door cellen van beide populatie. Bijvoorbeeld, antimicrobiële peptide cathelicidine aangetoond moduleren acute colitis. Maar wordt uitgedrukt in zowel epitheelcellen en immuuncellen (zoals macrofagen). Dan gebruikt bottransplantatie te definiëren welke populatie van cellen moduleert acute colitis bij muizen. De ernst colitis werd significant veranderd na de verandering van beenmerg cathelicidine genotypes via beenmergtransplantatie. Dan kunnen we concluderen dat cathelicidine uitgedrukt in beenmerg afgeleide cellen speelt een belangrijke rol bij het moduleren acute colitis in reactie op DSS.
Bone marrow afgeleide cellen omvatten meestal rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes. Beenmergtransplantatie verandert het genotype van deze cellen, maar andere niet. Zijdelings gesproken kan dit experiment alleen differentiëren de rol van gen-van-belang in beenmerg afgeleide cellen versus non-beenmerg afgeleide cellen. Maar dit experiment niet verder bepalen welke populatie van beenmerg afgeleide cellen bemiddelt de colitis en alle rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes zijn afgeleid van beenmerg. Het lot van beenmerg afgeleide cellen migreerden naar dubbele punten tijdens ulcerosa is een actief en omstreden aspect van het onderzoek. Na beenmergtransplantatie en inductie van murine colitis, is het waarschijnlijk dat enkele van beenmerg afgeleide cellen bestaan lymfoïde cellen en myofibroblasten in de colons 5. Een ander rapport stelde voor dat beenmerg afgeleide cellen dienen als endotheliale progenitorcellen voor neovascularisatie in het herstel proces 6. Er is ook evidence geeft beenmerg afgeleide cellen worden geassocieerd met epitheliale celdifferentiatie bij patiënten met colitis 7. We kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat sommige van beenmerg afgeleide cellen kunnen differentiëren tot cellen anders dan typische immuuncellen en spelen modulerende rol in colitis ontwikkeling. Niettemin beenmerg afgeleide monocyten / macrofagen bevolking belangrijk voor de bescherming tegen chemische geïnduceerde dikke mucosale schade 8,9. Dit rapport is in overeenstemming met onze bevinding dat cathelicidine uitgedrukt van beenmerg afgeleide cellen moduleert DSS colitis terwijl cathelicidine wordt afgescheiden van monocyten / macrofagen 4.
Anderzijds zijn er vele manieren om het succes van beenmergtransplantatie volgen. De flowcytometrie analyse van CD45.1 en CD45.2 genotypes kan een kwantitatieve methode om het aandeel van donor beenmerg stamcellen afgeleide cellen in de ontvangende muizen te bepalen. Beenmerg afgeleide cellens kunnen differentiëren in verschillende soorten cellen 10. Wanneer flowcytometrieanalyse niet mogelijk is, is het mogelijk om mannelijke (XY chromosoom) donormuizen en vrouwelijke (XX chromosoom) ontvangende muizen 11. De donor muizen voert unieke Y-chromosomen in het lichaam van XX alleen vrouwelijke ontvangende muizen. Y chromosoom kunnen worden geïdentificeerd door fluorescente in situ hybridisatie 11. Bovendien kunnen immunohistochemie van CD45.1, CD45.2 en / of het gen-van-belang in de weefsels noodzakelijk de donor beenmerg afgeleide cellen te visualiseren.
Maar CD45 flowcytometrieanalyse en Y chromosoom in situ hybridisatie procedures worden meestal uitgevoerd nadat de muizen opgeofferd. Toezien op de locatie van donor cellen in de ontvangende muizen worden gebruikt om chronische ziekten zoals kanker bestuderen zonder dat de muizen, is het mogelijk om groen fluorescent eiwit transgene muizen als donormuizen 12. Daarom is de donor bone martr afgeleide cellen kunnen worden bijgehouden in het lichaam van de ontvangende muizen onder niet-invasieve hoge resolutie optische beeldvorming onder wisselende verdoving en kan herhaaldelijk worden uitgevoerd.
Niet alle muizen hebben succesvolle beenmergtransplantatie 13. We zagen ~ 10-20% van de muizen sterven in de eerste 2 weken na de bestraling te wijten aan bloedarmoede of infectie. Daarom moeten meer muizen dan nodig worden bereid aan het begin van het experiment. Bijvoorbeeld maakt, moet u 10 muizen per groep aan het begin van het experiment wanneer u verwacht 8 muizen per groep die aan het einde van het experiment colitis. Zorg er ook voor het verwijderen van de dode muizen zo snel mogelijk. De snelheid van immuunreconstitutie is gecorreleerd aan het aantal van hematopoietische stamcellen in het beenmerg ingebracht in de ontvangende muizen 14. Daarom is het cruciaal om voldoende aantal levende beenmergcellen (1 x 10 7 cellen per muis) toegediend in ontvangende muizen voor succesvolle beenmerg transplantation.
Ontvangende muizen na bestraling hebben stoornissen van het immuunsysteem. Donormuizen dissectie en het beenmerg voorbereiding procedures moeten worden gedaan in de dezelfde standaard als celcultuur experimenten. Gebruik van steriele instrumenten en containers moet aseptische behandelingstechnieken worden toegepast. In alle experimenten PBS bevat 1% penicilline-streptomycine en 10 U / ml heparine worden gebruikt bij de behandeling van beenmerg. Alle reagentia zijn celcultuur rang. Aanvullende technische behandeling kan worden gevonden in referentie 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Pilot en haalbaarheidsstudie subsidie van UCLA-CURE Center, de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) en National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) financiering van Hon Wai Koon.
Beenmerg bestraling operatie werd bijgestaan door Bernard Levin en Scott Keuken van UCLA Center for AIDS Research muis / humaan Chimera Core faciliteit. Flowcytometrie operatie werd bijgestaan door UCLA Vector Core faciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
