Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Summary

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Abstract

Para entender el papel de un gen en el desarrollo de colitis, se compararon las respuestas de los ratones de tipo salvaje y el gen de interés ratones knockout deficientes a colitis. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas del huésped, sin embargo, es posible diferenciar el papel de un gen de interés en células de médula ósea derivadas de médula y no óseo células derivadas mediante la técnica de trasplante de médula ósea. Para cambiar la médula ósea procedentes de células genotipo de los ratones, la médula ósea original de los ratones receptores fueron destruidas por irradiación y luego se sustituye por la nueva médula ósea del donante de genotipo diferente. Cuando de tipo salvaje ratones donantes de médula ósea se trasplantan a ratones knockout, se podría generar ratones knockout con la expresión del gen de tipo salvaje en células de médula ósea derivadas. Por otra parte, cuando los donantes ratones knockout médula ósea trasplantadas a ratones receptores de tipo salvaje, de tipo salvaje ratones sin el gen de interés expresarde la médula ósea células derivadas fueron producidos. Sin embargo, el trasplante de médula ósea puede no ser 100% completo. Por lo tanto, hemos utilizado cúmulo de diferenciación (CD) moléculas (CD45.1 y CD45.2) como marcadores de las células del donante y del receptor para realizar un seguimiento de la proporción de células de la médula ósea de un donante derivados en los ratones receptores y el éxito de los trasplantes de médula ósea. De tipo salvaje ratones con genotipo CD45.1 ratones knockout y con CD45.2 genotipo fueron utilizados. Después de la irradiación de ratones receptores, las células donantes de médula ósea de diferentes genotipos fueron infundidas en los ratones receptores. Cuando la nueva médula ósea regenerada para hacerse cargo de su inmunidad, los ratones se expusieron por agentes químicos (sulfato de dextrano sódico, DSS al 5%) para inducir la colitis. Aquí también mostró el método para inducir la colitis en ratones y evaluar la función del gen de interés expresado a partir de células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés a partir de las células óseas derivadas juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad (tal como Escherichiatis), el fenotipo de los ratones receptores con trasplante de médula ósea puede ser alterado de manera significativa. Al final de los experimentos de colitis, la médula ósea derivada células en la sangre y la médula ósea se marcaron con anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2 y su proporción cuantitativa de la existencia podría ser usado para evaluar el éxito del transplante de médula ósea por citometría de flujo. Éxito del trasplante de médula ósea debe mostrar una gran mayoría de genotipo donante (en término de marcador molécula de CD) a lo largo genotipo receptor tanto en la médula ósea y la sangre de los ratones receptores.

Protocol

1. Antes-de-empezar Consideraciones técnicas Le recomendamos que use C57/BL6 ratones de tipo salvaje y ratones knockout para el experimento porque los ratones con moléculas de CD correspondientes pueden adquirirse de los proveedores más importantes del ratón. Puesto que es difícil realizar un seguimiento de los ratones de tipo salvaje y de ratones knockout derivados células del donante después del trasplante de médula ósea, es necesario utilizar CD45.1 ratones para representar ratones de ti…

Representative Results

Si el gen de interés desempeña un papel significativo en las células inmunes durante el desarrollo de la colitis, los ratones que recibieron médula ósea de genotipo diferente a través de trasplante de médula ósea (WT a KO o KO a WT) debería tener una respuesta alterada a la colitis DSS. Uno de los parámetros más importantes para la determinación de la gravedad de la colitis es la tinción H & E de los tejidos de colon. Colon cambios en la estructura de tejido y los signos de la inflamación pueden evalua…

Discussion

Este enfoque trasplante de médula ósea es adecuado para la investigación de la inmunología colitis, infección, cáncer, obesidad y otras enfermedades. Este experimento de trasplante de médula ósea es necesaria cuando el gen de interés se expresa en tanto derivadas de médula ósea y no células de la médula ósea derivados y el gen de interés se sospecha para mediar la enfermedad por células de cualquiera de la población. Por ejemplo, péptido antimicrobiano de catelicidina está demostrado que modulan la co…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Cell staining buffer	Biolegend	#420201
10X RBC lysis buffer	Biolegend	#420301
FITC mouse isotype control	Biolegend	#400207
PE mouse isotype control	Biolegend	#400211
PE anti-mouse CD45.2	Biolegend	#109807
FITC anti-mouse CD45.1	Biolegend	#110705
Anti-mouse CD16/32 blocking	Biolegend	#101301
40 μm cell strainer	Fisherbrand	#22363547
PBS 1X	MP biomedicals	#1860454
Heparin	Fisherbrand	#BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (fisher)
Lysol IC	Andwin Scientific	NC9745686 (fisher)
Vaccutainer	BD	#8000813
Mouse restrainer	Braintree Scientific	#TV-150
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates	Mark I 68A
Flow cytometer	BD	BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube	Falcon	#352052
Digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW