Summary

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

زرع نخاع العظام يوفر وسيلة لتغيير التركيب الوراثي للخلايا نخاع العظام المستمدة. إذا يعبر عن الجينات ذات الأهمية في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظم غير المشتقة، يمكن زرع نخاع العظام تغيير خلايا نخاع العظام المستمدة إلى التركيب الوراثي مختلفة دون تغيير التركيب الوراثي غير العظام نخاع الخلية مشتقة.

Abstract

لفهم دور الجينات في تطوير التهاب القولون، قارنا ردود البرية من نوع الفئران والجينات في المصالح الفئران خروج المغلوب لنقص التهاب القولون. إذا يعبر عن الجينات في المصالح في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير للمضيف، ولكن من الممكن التفريق بين دور الجينات في المصالح في خلايا نخاع العظام ونخاع المستمدة غير العظام مشتقة من خلايا نخاع العظام تقنية الزرع. لتغيير التركيب الوراثي نخاع العظام المستمدة من الفئران الخلية، تم تدمير النخاع العظمي الأصلي من الفئران المتلقية من قبل التشعيع وبعد ذلك استبدال نخاع العظام المانحة الجديدة من النمط الجيني مختلفة. عندما تم زرع العظام من النوع البري المانحة الفئران الفئران خروج المغلوب لنخاع، يمكن أن تولد الفئران خروج المغلوب مع التعبير الجيني من النوع البري في خلايا نخاع العظام المستمدة. بدلا من ذلك، تم زرعها عند الفئران خروج المغلوب المانحة نخاع العظم للفئران المستفيدة من النوع البري والبرية من نوع الفئران دون الجينات في المصالح معربا عنمن نخاع العظم تم إنتاج الخلايا المشتقة. ومع ذلك، قد زرع نخاع العظم لا يكون 100٪ كاملة. ولذلك، تستخدم مجموعة من الجزيئات نحن (CD) التمايز (CD45.1 وCD45.2) كعلامات من الخلايا المانحة والمتلقية لتتبع نسبة من الخلايا المانحة نخاع العظام في الفئران المستمدة المستفيدة ونجاح زرع نخاع العظام. واستخدمت البرية من نوع الفئران مع الفئران خروج المغلوب وراثى CD45.1 مع CD45.2 الوراثي. بعد التشعيع من الفئران المتلقية، وغرست في خلايا نخاع العظام من المانحين الأنماط الوراثية في الفئران المتلقية. وعندما نخاع العظام الجديدة المجددة للاستيلاء على حصانتها، تحدى الفئران عن طريق وكيل الكيميائية (ديكستران كبريتات الصوديوم، 5٪ DSS) للحث على التهاب القولون. نحن هنا كما أظهرت طريقة للحث على التهاب القولون في الفئران وتقييم دور الجينات في المصالح وأعرب عن خلايا نقي العظم المشتقة. إذا كان الجين في المصالح من خلايا العظام المستمدة تلعب دورا هاما في تطور هذا المرض (مثل القولونيةTIS)، يمكن النمط الظاهري من الفئران المتلقية مع زرع نخاع العظام غيرت بشكل كبير. في نهاية التجارب التهاب القولون، ونخاع العظام المستمدة وصفت الخلايا في الدم ونخاع العظام مع الأجسام المضادة ضد CD45.1 وCD45.2، ويمكن استخدامها على نسبة الكمية من وجودها لتقييم نجاح زرع نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. يجب ناجحة زرع نخاع العظام تظهر الغالبية العظمى من النمط الجيني المانحة (في فترة من علامة جزيء CD) على النمط الجيني المستلم في كل من نخاع العظام والدم من الفئران المتلقية.

Protocol

1. قبل بدء أنت بين الاعتبارات الفنية نوصي باستخدام كل C57/BL6 البرية من نوع الفئران والفئران خروج المغلوب للتجربة لأنه يمكن شراؤها الفئران مع جزيئات CD المقابلة من الباعة الماوس كبيرة. لأنه من ا?…

Representative Results

يجب إذا كان الجين في المصالح تلعب دورا هاما في الخلايا المناعية خلال تطوير التهاب القولون، والفئران تلقي نخاع العظم من النمط الجيني المختلفة من خلال زرع نخاع العظم (WT إلى KO KO أو لWT) لديها تغيير في الاستجابة للالتهاب القولون DSS. واحدة من أهم المعايير لتحديد شدة التهاب ا…

Discussion

هذا زرع نخاع العظم نهج مناسبة للبحوث المناعة التهاب القولون، والعدوى، والسرطان، والسمنة وأمراض أخرى. هناك حاجة لذلك زرع نخاع العظم عند تجربة أعرب عن الجينات في المصالح في كل من نخاع العظم والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير ويشتبه الجين في المصالح للتوسط المر…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الطيار والجدوى منحة دراسة من جامعة كاليفورنيا-CURE سنتر، والتهاب القولون كرون ومؤسسة جائزة الوظيفي أمريكا التنمية (# 2691) والمعهد الوطني للصحة NIDDK K01 (DK084256) لتمويل هون واي KOON.

وساعد عملية التشعيع نخاع العظام من ليفين وبرنار سكوت مطبخ مركز UCLA للبحوث الإيدز ماوس / مرفق الإنسان الأساسية الوهم. وساعد تدفق الخلوي بواسطة عملية منشأة UCLA الأساسية المتجهات.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Play Video

Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

View Video