Benmargstransplantasjon gir en måte å endre genotype i benmargen avledet celler. Dersom genet av interesse er uttrykt i begge benmargsceller avledet celler og ikke-benmarg avledet celler, kan benmargstransplantasjon endre benmargsceller avledet celler til en annen uten å endre genotypen ikke-beinmargen avledet celle genotype.
For å forstå hvilken rolle et gen i utviklingen av kolitt, sammenlignet vi svarene på villtype mus og gen-of-interesse mangelfull knockout mus til kolitt. Hvis genet-of-interesse uttrykkes i begge benmargsceller avledet celler og ikke-benmarg avledet celler av verten, men, er det mulig å differensiere rollen av et gen av interesse i benmarg avledet celler og ikke-benmarg avledet celler ved benmargstransplantasjon teknikk. Å endre benmargen avledet celle genotype av mus, ble den opprinnelige benmargen mottakerland mus ødelagt av stråling og deretter erstattet av ny donor benmarg av ulike genotype. Når villtype mus donor beinmargen ble transplantert til knockout-mus, kan vi generere knockout mus med villtype genuttrykk i benmarg avledet celler. Alternativt ble da knockout mus donor beinmargen transplantert til villtype mottaker mus, villtype mus uten gen-of-interesse uttrykkerfra benmarg avledet celler ble produsert. Imidlertid kan benmargstransplantasjon ikke være 100% fullført. Derfor benyttet vi klynge av differensiering (CD) molekyler (CD45.1 og CD45.2) som markører for donor og mottaker celler å spore andelen donor benmarg avledet celler i mottakerlandene mus og suksess av benmargstransplantasjon. Villtype mus med CD45.1 genotype og knockout mus med CD45.2 genotype ble brukt. Etter bestråling av mottaker mus ble donor benmargsceller forskjellige genotyper infunderes i mottakeren mus. Når den nye beinmargen regenereres til overta dens immunitet, ble musene utfordret av kjemisk middel (dekstran natriumsulfat DSS 5%) for å indusere kolitt. Her finner vi også viste metode for å indusere kolitt i mus og vurdere rollen til genet av interesse uttrykt fra benmarg avledet celler. Hvis genet-of-interesse fra beinet avledet cellene spiller en viktig rolle i utviklingen av sykdommen (som colitis), kan fenotypen av mottaker mus med benmargstransplantasjon bli betydelig endret. På slutten av kolitt eksperimenter, benmargen avledet celler i blod og benmarg ble merket med antistoffer mot CD45.1 og CD45.2 og deres kvantitative forholdet eksistens kan brukes for å vurdere effekten av benmargstransplantasjon ved strømningscytometri. Vellykket benmargstransplantasjon skal vise et stort flertall av donor genotype (på sikt av CD molekyl markør) over mottakeren genotype i både benmarg og blod mottaker mus.
Denne benmargstransplantasjon tilnærming er egnet for immunologi forskning av kolitt, infeksjon, kreft, fedme og andre sykdommer. Denne benmargstransplantasjon eksperimentet trengs når genet-of-interesse uttrykkes i både beinmargen avledet og ikke-benmargsceller avledet celler og genet-of-interesse mistenkes å mediere sykdom ved celler fra enten populasjonen. For eksempel, er antimikrobielle peptidet cathelicidin vist å modulere akutt kolitt. Men det er uttrykt i både epitelceller og immunceller (for eksempel makr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Pilot og Feasibility Study stipend fra UCLA-CURE Center, Crohns og kolitt Foundation of America Career Development Award (# 2691) og National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) midler til Hon Wai Koon.
Benmarg bestråling operasjonen ble assistert av Bernard Levin og Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research Mouse / Human Chimera Kjerne anlegget. Flowcytometri operasjonen ble assistert av UCLA Vector Kjerne anlegget.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
Vaccutainer | BD | #8000813 |
Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |