Summary

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

Benmärgstransplantation ger ett sätt att ändra genotypen av ben härrör benmärgsceller. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler, kan benmärgstransplantation ändra benmärg härledda celler till en annan genotyp utan att ändra den icke-benmärg härledd cell genotyp.

Abstract

För att förstå betydelsen av en gen i utvecklingen av kolit, jämförde vi svaren från vildtyp möss och gen av intresse brist möss knockout på kolit. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärgsceller härledda celler hos värden, men det är möjligt att differentiera rollen av en gen av intresse i ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler genom benmärgstransplantation teknik. För att ändra benmärgen härledda celler genotyp av möss var den ursprungliga benmärgen hos mottagande möss förstördes av bestrålning och sedan ersätts av nya givare benmärg olika genotyp. När vildtyp möss givare benmärg transplanterades till knockout-möss, kunde vi generera knockout-möss med vildtyp genexpression i ben härledda benmärgsceller. Alternativt var när knockoutmöss donator benmärg transplanteras till vildtyp mottagare möss, vildtyp möss utan gen av intresse som uttryckerfrån benmärg härledda celler producerades. Emellertid kan benmärgstransplantation inte 100% fullständig. Därför använde vi kluster av differentiering (CD) molekyler (CD45.1 och CD45.2) som markörer för givar-och celler att spåra andelen givarens benmärg härledda celler i mottagande möss och framgång av benmärgstransplantation. Vildtyp möss med CD45.1 genotyp och knockout-möss med genotyp CD45.2 användes. Efter bestrålning av mottagande möss, var givarens benmärgsceller från olika genotyper infuseras i de mottagande mössen. När den nya benmärg regenereras att ta över dess immunitet, utmanades mössen genom kemisk agens (dextran natriumsulfat, DSS 5%) för att inducera kolit. Här har vi också visat att metoden för att inducera kolit i möss och utvärdera rollen av genen av intresse uttrycks från benmärg härledda celler. Om genen av intresse från de härledda bencellerna spelar en viktig roll i utvecklingen av sjukdomen (t.ex. E. colitis), kan fenotypen för de mottagande möss med benmärgstransplantation vara signifikant. Vid slutet av kolit experiment, benmärgen härledda celler i blod och benmärg märktes med antikroppar mot CD45.1 och CD45.2 och deras kvantitativa förhållande existerar kan användas för att utvärdera framgången med benmärgstransplantation genom flödescytometri. Framgångsrik benmärgstransplantation ska visa en stor majoritet av givare genotyp (i tid av CD-molekyl markör) över mottagare genotyp i både benmärgen och blod mottagande möss.

Protocol

1. Innan-du-start tekniska överväganden Vi rekommenderar att du använder både C57/BL6 vildtyp möss och möss knockout för experiment eftersom möss med motsvarande cd-molekyler kan köpas från de stora mus leverantörer. Eftersom det är svårt att spåra vildtyp möss och möss knockout härledda givarceller efter benmärgstransplantation, är det nödvändigt att använda CD45.1 möss för att representera vildtypsmöss. (CD45.1 C57/SJL WT möss Jackson Laboratories lager # 002.014). <…

Representative Results

Om genen av intresse spelar en viktig roll i immuna celler under utvecklingen av kolit, de möss som fick benmärg av olika genotyp genom benmärgstransplantation (WT KO eller KO till WT) bör ha ett förändrat respons på DSS kolit. En av de viktigaste parametrarna för att bestämma graden av kolit är H & E-färgning av kolon vävnad. Kolonvävnad struktur förändringar och tecken på inflammation kan kvantitativt utvärderas genom H & E-histologi poängsystem. Kriterier för H & E histologi poäng för…

Discussion

Denna benmärgstransplantation tillvägagångssätt är lämpligt för immunologi forskning av kolit, infektion, cancer, fetma och andra sjukdomar. Denna benmärgstransplantation experiment behövs när genen av intresse uttrycks i båda härledda benmärg och icke-benmärg härledda celler och genen av intresse misstänks förmedla sjukdom av celler från endera populationen. Exempelvis antimikrobiell peptid cathelicidin visats modulera akut kolit. Men det uttrycks i både epitelceller och immunceller (såsom makrofage…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete har finansierats av Pilot och genomförbarhetsstudien bidrag från UCLA-CURE Center, Crohns och kolit Foundation of America Karriärutveckling Award (# 2691) och National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) finansiering Hon Wai Koon.

Benmärg bestrålning operationen hjälp av Bernard Levin och Scott kök av UCLA Center for AIDS Research mus / human Chimera core facility. Flödescytometri drift fick hjälp av UCLA Vector Core Facility.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Play Video

Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

View Video