Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation
Summary
Benmärgstransplantation ger ett sätt att ändra genotypen av ben härrör benmärgsceller. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler, kan benmärgstransplantation ändra benmärg härledda celler till en annan genotyp utan att ändra den icke-benmärg härledd cell genotyp.
Abstract
För att förstå betydelsen av en gen i utvecklingen av kolit, jämförde vi svaren från vildtyp möss och gen av intresse brist möss knockout på kolit. Om genen av intresse uttrycks i båda ben härledda märgceller och icke-benmärgsceller härledda celler hos värden, men det är möjligt att differentiera rollen av en gen av intresse i ben härledda märgceller och icke-benmärg härledda celler genom benmärgstransplantation teknik. För att ändra benmärgen härledda celler genotyp av möss var den ursprungliga benmärgen hos mottagande möss förstördes av bestrålning och sedan ersätts av nya givare benmärg olika genotyp. När vildtyp möss givare benmärg transplanterades till knockout-möss, kunde vi generera knockout-möss med vildtyp genexpression i ben härledda benmärgsceller. Alternativt var när knockoutmöss donator benmärg transplanteras till vildtyp mottagare möss, vildtyp möss utan gen av intresse som uttryckerfrån benmärg härledda celler producerades. Emellertid kan benmärgstransplantation inte 100% fullständig. Därför använde vi kluster av differentiering (CD) molekyler (CD45.1 och CD45.2) som markörer för givar-och celler att spåra andelen givarens benmärg härledda celler i mottagande möss och framgång av benmärgstransplantation. Vildtyp möss med CD45.1 genotyp och knockout-möss med genotyp CD45.2 användes. Efter bestrålning av mottagande möss, var givarens benmärgsceller från olika genotyper infuseras i de mottagande mössen. När den nya benmärg regenereras att ta över dess immunitet, utmanades mössen genom kemisk agens (dextran natriumsulfat, DSS 5%) för att inducera kolit. Här har vi också visat att metoden för att inducera kolit i möss och utvärdera rollen av genen av intresse uttrycks från benmärg härledda celler. Om genen av intresse från de härledda bencellerna spelar en viktig roll i utvecklingen av sjukdomen (t.ex. E. colitis), kan fenotypen för de mottagande möss med benmärgstransplantation vara signifikant. Vid slutet av kolit experiment, benmärgen härledda celler i blod och benmärg märktes med antikroppar mot CD45.1 och CD45.2 och deras kvantitativa förhållande existerar kan användas för att utvärdera framgången med benmärgstransplantation genom flödescytometri. Framgångsrik benmärgstransplantation ska visa en stor majoritet av givare genotyp (i tid av CD-molekyl markör) över mottagare genotyp i både benmärgen och blod mottagande möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna benmärgstransplantation tillvägagångssätt är lämpligt för immunologi forskning av kolit, infektion, cancer, fetma och andra sjukdomar. Denna benmärgstransplantation experiment behövs när genen av intresse uttrycks i båda härledda benmärg och icke-benmärg härledda celler och genen av intresse misstänks förmedla sjukdom av celler från endera populationen. Exempelvis antimikrobiell peptid cathelicidin visats modulera akut kolit. Men det uttrycks i både epitelceller och immunceller (såsom makrofage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Pilot och genomförbarhetsstudien bidrag från UCLA-CURE Center, Crohns och kolit Foundation of America Karriärutveckling Award (# 2691) och National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) finansiering Hon Wai Koon.
Benmärg bestrålning operationen hjälp av Bernard Levin och Scott kök av UCLA Center for AIDS Research mus / human Chimera core facility. Flödescytometri drift fick hjälp av UCLA Vector Core Facility.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
| Vaccutainer | BD | #8000813 |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
| Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
