Summary

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Published: October 01, 2012
doi:

Summary

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Abstract

Kolit gelişimi arasında bir genin rolünü anlamak için, wild-tip farelerden ve kolit gen-faiz eksik nakavt fareler yanıtları karşılaştırıldı. Gen-of-ilgi kemik iliğinden elde edilen ve konak hücreleri olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, fakat kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliği içinde bir ilgi geninin rol ayırt etmek mümkündür kemik iliği nakli tekniği ile elde edilen kök hücrelerin. Farelerin kemik iliği kaynaklı hücre genotipi değiştirmek için, alıcı fareler orijinal kemik iliği radyasyon tarafından tahrip ve daha sonra farklı genotip yeni donör kemik iliği tarafından değiştirildi. Wild-tip farelerden donör kemik iliği knockout farelerde transplante edildiğinde, kemik iliğinden elde edilen hücreleri vahşi tip gen ekspresyonu ile nakavt fareler yaratacaktır. Alternatif olarak, ne zaman nakavt fareler donör kemik iliği gen-faiz ifade vermeden yabani tip alıcı fareler, yabani tip farelere nakledildiKemik iliği kaynaklı hücre üretilmiştir. Bununla birlikte, kemik iliği nakli,% 100 eksik olabilir. Bu nedenle, alıcı fareler ve kemik iliği nakli başarı donör kemik iliğinden elde hücrelerinin oranını izlemek için verici ve alıcı hücre belirteçleri olarak farklılaşma (CD) moleküllerinin kümelenme (CD45.1 ve CD45.2) kullanılmıştır. CD45.2 genotipi ile CD45.1 genotip ve nakavt fareler Wild-tip fareler kullanılmaktadır. Alıcı fareler ışınlanması sonra, farklı genotiplerin donör kemik iliği hücreleri alıcı fareler infüze edildi. Yeni kemik iliği onun dokunulmazlığını devralmaya rejenere zaman, farelerin kolit oluşturulan kimyasal ajan (dekstran sodyum sülfat, DSS% 5) tarafından itiraz edildi. İşte biz de farelerde kolit oluşturulan ve kemik iliğinden elde edilen hücrelerden eksprese ilgilenilen genin rolünü değerlendirmek için yöntem gösterdi. Kemik türetilmiş hücrelerden gen-of-ilgi hastalığının gelişmesinde önemli bir rol (örneğin coli gibi yürütülürsetis), kemik iliği nakli ile alıcı farelerin fenotipi önemli ölçüde değiştirilebilir. Kolit deneyler sonunda, kemik iliği kan ve kemik iliği hücreleri CD45.1 ve CD45.2 karşı antikorlar ile etiketlenmiş edildi ve varoluş nicel oranı flow sitometri ile kemik iliği nakli başarısını değerlendirmek için kullanılan olabilir türetilmiştir. Başarılı kemik iliği nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de alıcı genotip üzerinde donör genotipi (CD molekülünün marker vadede) büyük bir çoğunluğu göstermelidir.

Protocol

1. Önce-sen-start Teknik Hususlar Ilgili CD molekülleri ile farelerin büyük fare satıcılardan satın alınabilir çünkü deney için C57/BL6 wild-tip farelerden ve nakavt fareler hem kullanmanızı öneririz. Bunu wild-tip farelerden ve kemik iliği transplantasyonu sonrası donör hücreleri türetilmiş nakavt fareler izlemek zor olduğundan, wild-tip farelerden temsil CD45.1 fareler kullanmak gereklidir. (CD45.1 C57/SJL WT farelerde Jackson Laboratuvarları stok # 002014). En ço…

Representative Results

Gen-faiz kolit gelişimi sırasında bağışıklık hücrelerinin önemli bir rol oynarsa, farelerin kemik iliği transplantasyonu (WT KO veya WT KO) aracılığıyla farklı genotip kemik iliği alma DSS kolit değiştirilmiş bir yanıtı olmalıdır. Kolit şiddetini belirleyen en önemli parametrelerden biri kolon dokularında H & E boyama olduğunu. Kolon doku yapısı değişiklikleri ve inflamasyon belirtileri kantitatif H & E histolojisi skorlama sistemi ile değerlendirilebilir. H & DSS kolit model…

Discussion

Bu, kemik iliği transplantasyonu yaklaşım immünoloji kolit araştırma, enfeksiyon, kanser, aşırı şişmanlık ve diğer hastalıklar için de uygundur. Bu kemik iliği nakli deneyi gen-faiz hem de kemik iliğinden elde edilen ve non-kemik iliğinden elde edilen hücreleri ve gen-faiz ya nüfus hücreleri tarafından hastalık arabuluculuk şüphelenilen ifade edildiğinde gereklidir. Örneğin, antimikrobiyal peptit katelisidin akut kolit modüle etmek için gösterilir. Ancak epitel hücreleri ve bağışıklı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma UCLA-CURE Merkezi, Crohn ve Amerika Kariyer Geliştirme Ödülü (# 2691) ve Sağlık NIDDK K01 Ulusal Enstitüsü (DK084256) Hon Wai Koon finansman Kolit Vakfı Pilot ve Fizibilite Çalışması hibe ile finanse edildi.

Kemik iliği ışınlama işlemi Bernard Levin ve AIDS Araştırma Fare / İnsan Chimera Çekirdek tesisi için UCLA Merkezi'nde Scott Mutfak tarafından yardım edildi. Flow sitometri çalışması UCLA Vektörel Çekirdek tesisi tarafından yardım edildi.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Cell staining buffer Biolegend #420201
10X RBC lysis buffer Biolegend #420301
FITC mouse isotype control Biolegend #400207
PE mouse isotype control Biolegend #400211
PE anti-mouse CD45.2 Biolegend #109807
FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend #110705
Anti-mouse CD16/32 blocking Biolegend #101301
40 μm cell strainer Fisherbrand #22363547
PBS 1X MP biomedicals #1860454
Heparin Fisherbrand #BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (fisher)
Lysol IC Andwin Scientific NC9745686 (fisher)
Vaccutainer BD #8000813
Mouse restrainer Braintree Scientific #TV-150
Irradiator J.L. Shepherd and Associates Mark I 68A
Flow cytometer BD BD FACSCanto II
Flow cytometer test tube Falcon #352052
Digital caliper Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult ICT Beckman Coulter G0328QW

References

  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
  3. Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
  4. Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
  5. Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
  6. Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
  7. Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
  8. Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
  9. Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
  10. Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
  11. Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
  12. Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
  13. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
  14. Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).

Play Video

Cite This Article
Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation. J. Vis. Exp. (68), e4208, doi:10.3791/4208 (2012).

View Video