Summary
骨髄移植は、骨髄由来細胞の遺伝子型を変更する方法を提供します。目的の遺伝子が骨髄由来細胞と非骨髄由来細胞の両方で発現されている場合は、骨髄移植では、非骨髄由来細胞の遺伝子型を変更することなく、異なる遺伝子型に骨髄由来細胞を変更することができます。
Abstract
大腸炎の開発における遺伝子の役割を理解するために、我々は、野生型マウスと大腸炎に目的遺伝子欠損ノックアウトマウスの応答を比較した。目的遺伝子は、骨髄由来の細胞とホストの非骨髄由来細胞の両方で発現される場合、ただし、それは、骨髄由来の細胞と非骨髄に目的の遺伝子の役割を区別することが可能である骨髄移植技術によって誘導された細胞。マウスの骨髄由来細胞の遺伝子型を変更するには、レシピエントマウスのオリジナルの骨髄を照射して破壊され、その後、別の遺伝子型の新しいドナー骨髄に取って代わられた。野生型マウスのドナー骨髄をノックアウトマウスに移植したとき、我々は骨髄由来の細胞における野生型遺伝子の発現とノックアウトマウスを生成することができます。あるいは、時のノックアウトマウスドナー骨髄は目的遺伝子を発現せず、野生型レシピエントマウスは、野生型マウスに移植した骨髄由来の細胞を作製した。しかし、骨髄移植は100％完全ではありません。そこで、レシピエントマウスと骨髄移植の成功におけるドナー骨髄由来の細胞の割合を追跡するために、ドナーとレシピエント細胞のマーカーとして分化（CD）の分子のクラスタ（CD45.1とCD45.2）を利用。 CD45.2遺伝子型を持つCD45.1遺伝子型とノックアウトマウスと野生型マウスを用いた。レシピエントマウスの照射後、異なる遺伝子型のドナー骨髄細胞をレシピエントマウスに注入した。新しい骨髄がその免疫を引き継ぐために再生したときに、マウスは大腸炎を誘導する化学剤（デキストラン硫酸ナトリウム、DSSの5％）でチャレンジした。ここで我々はまた、マウスでは大腸炎を誘導し、骨髄由来の細胞から発現対象の遺伝子の役割を評価するための手法を示した。骨由来の細胞から目的遺伝子は、疾患の発症に重要な役割を（例えば大腸菌などに再生される場合TIS）、骨髄移植によるレシピエントマウスの表現型を大幅に変更することができます。大腸炎の実験の最後に、血液や骨髄中の細胞を骨髄由来がCD45.1とCD45.2に対する抗体と存在の彼らの量的比率を用いて標識したフローサイトメトリーにより、骨髄移植の成功を評価するために使用することができる。成功した骨髄移植はレシピエントマウスの骨髄や血液の両方で受信者の遺伝子型以上のドナー遺伝子型（CD分子マーカーの任期で）の大半を示すべきである。
Protocol
1。前あなたスタート技術的な考慮事項
- 対応するCD分子とマウスはマウスの主要ベンダーから購入することができますので、我々は実験のためにC57/BL6野生型マウスとノックアウトマウスの両方を使うことをお勧めします。
- それは、骨髄移植後の野生型マウスとノックアウトマウス由来のドナー細胞を追跡するのは困難であるので、それは野生型マウスを表すためにCD45.1マウスを使用する必要があります。 （CD45.1 C57/SJL WTマウスジャクソン研究所の株式＃002014）。
- ほとんどのマウスコロニーがCD45.2です。私たちのノックアウトマウスは、CD45.2遺伝子型（：ジャクソン研究所株式＃000664交互CD45.2 WTマウスソース）に属しています。 CD45.1またはCD45.2遺伝子型の決定は、このプロトコルのセクション7で説明したように、骨髄や末梢血のフローサイトメトリーを用いて行うことができる。
- 照射後のマウスは、免疫力を損なわれている。病原体フリー施設でマウスをおいてください。
- 照射装置の動作は、特別なセキュリティを必要とするclearanceとトレーニング。訓練および承認プロセスに時間を節約するために、それは照射装置を操作することができる資格を持つ技術者による実験室と協力するのが最善です。
- 多くの機関は、経験豊富な技術者とフローサイトメトリー実験室を持っています。フローサイトメトリーの動作に問題を最小限に抑えるために、それはあなたが開始する前に、経験豊富な技術者を使ってフローサイトメトリー実験計画を議論することをお勧めします。
- マウス（各群10匹）、このように割り当てられていた：
| グループ | 受信者への骨髄ドナー | 治療 | |
| A | BMの交換 | CD45.1 WTにCD45.2 KO | DSS大腸炎 |
| B | 水の正常なコントロール | ||
| C言語 | BMの交換 | CD45.1 WTにCD45.2 KO | DSS大腸炎 |
| D | 水の正常なコントロール | ||
| E | ごまかし | CD45.1 WTにCD45.1 WT | DSS大腸炎 |
| F | 水の正常なコントロール | ||
| G | ごまかし | CD45.2 KOへCD45.2 KO | DSS大腸炎 |
| H | 水の正常なコントロール |
実験プロトコルの*簡単な例を図1に示します。
2。レシピエントマウス照射
- マウスは飼育と無菌施設に保管されています。フィルタ付きのオートクレーブ処理照射パイでマウスを置きます。照射パイの各スロットに1マウスを置きます。照射器にパイを置き、ターンテーブルとパイが回っていることを確認してください。
- エアーポンプの電源を入れ換気のために。照射装置のドアを閉じてロックします。
- 10分（放射線源及び半減期に応じて）約1,000ラド（10グレイに相当）をマウスに照射します。この時点から、放射線照射したマウスは免疫不全で、感染に弱い免疫を持っています。照射後、パイを取り出して、動物施設におけるバイオセーフティキャビネットへの輸送のための無菌の容器に入れる。感染の機会を最小限にするために外部環境にマウスを近づけないようにしてください。
- バイオセーフティキャビネット内で、（ - 水100ml当たり3.12ミリリットルをケージあたり4匹sulfatrim懸濁液と新しい滅菌水を追加）オートクレーブした寝具を使用してオートクレーブしたマウスのケージにマウスを移す。
- 抗生物質は光感受性であるためアルミホイルで水のボトルを包む。ケージにそれをロードする前によくsulfatrimソリューションボトルを混ぜてシェイク。
3。ドナー骨髄の抽出
- 二酸化炭素またはisoflur持つマウスを生け贄に捧げるインピーダンスその後1:200ライゾール溶液中に浸す。肌を濡らし、オープン骨を切開し、70％エタノールでマウスをスプレーしてください。
- 滅菌のための70％エタノール中で解剖器具を浸す。
- バイオセーフティキャビネット内郭清を行う。筋肉や靭帯を取り付けるから無料上腕骨、大腿骨、脛骨と腓骨の骨を露出させ、無菌の解剖器を使用します。
- 赤色骨髄を表示するために骨の両端を切り開く。ピンセットで骨を保持します。シャーレに3mlの注射器と25G針で冷PBSで赤色骨髄を洗い流す。より骨髄細胞を生成するために骨の両端からフラッシュします。
- 繰り返し吸引と吐出によって赤色骨髄プラグを壊すために6ミリリットルのシリンジと18G1 / 2の注射針を使用しています。 50mlのFalconチューブで骨髄を転送します。
- 4℃で5分間のために1800回転で骨髄をスピンダウン5から10秒間ボルテックスすることにより上清、ペレットを再懸濁しを破棄します。
- 滅菌水で10倍のRBC溶解緩衝液で希釈します。広告D 1X RBC溶解バッファー（ドナーマウスあたり5ml）、5秒間再びボルテックスし、室温で正確に3分間保つ。
- 3分後、溶解及び混合を停止するには、20ミリリットル冷PBSでチューブを埋める。新しい50mlファルコンチューブに直接40μmのセルストレーナーを介してコンテンツを注ぐ。
- 5mlのPBSで元のチューブを洗浄し、同様にセルストレーナーに転送されます。 PBSおよびミックスで50mlに水を補充して下さい。
4。骨髄ドナー細胞をカウント
- エッペンドルフチューブ、エッペンドルフチューブとミックスに骨髄懸濁液100μlにトリパンブルーの100μlを添加する。血球計数器に染色された細胞混合物をピペット。
- 細胞の量は、16の正方形でファルコンチューブ=非染色細胞数×2（トリパンブルーの希釈に起因する）×10,000×50ミリリットルの総リビング骨髄細胞数によって計算され
- 4℃で5分間、2,000 rpmで50ミリリットルのファルコンチューブに骨髄細胞をスピンダウン
- 上清を取り除きます。基づい総細胞数で、1mlあたり1×10 8個の細胞をPBSでペレットを再懸濁
5。レシピエントマウスに注入
- 熱パッド上と温暖ランプの下で、レシピエントマウスを温める。拘束中のレシピエントマウスを置きます。静脈内に100から200μlにマウスあたり1×10 7個の細胞を注入します。
- ドナー骨髄の注入は、照射後4から24時間の間に行わなければなりません。
- ケージあたり4注射したマウスについていく。病原体フリー動物施設の最初の4週間の抗生物質で処理した水を用いてオートクレーブしたケージの中に注入されたレシピエントマウスを維持し、マウスは免疫力を取り戻すことができます。衛生状態を維持するために4日毎にはケージ、抗生物質で処理した水や食料を変更します。
6。大腸炎や大腸炎の評価の誘導
- 4週間照射と骨髄移植後に、それらの正常を取り戻すために抗生物質を含まない通常の水に切り替えて、さらに2週間のマウスを維持叢を腸。
- 6週間骨髄注入後、初期の体重を測定します。いくつかのマウスは大腸炎を誘発するために水を自由に摂取を飲んで5％硫酸デキストランを与えられている。一部のマウスでのみ正常対照群として定期的な飲料水を与えられている。
- 5日後、末梢血を撤回し、ヘパリンコーティングチューブ（バキュテイナー）に転送して、氷の中に保管してください。 1チューブに4匹から血液をプール。 =600μlの細胞染色バッファ300μlの血液300μlのを兼ね備えています。 100μlで5エッペンドルフチューブ、それぞれに血を分けてください。
- 二酸化炭素又はイソフルランを持つマウスを生け贄に捧げる。巨視的な損傷のスコア（詳細1のための別のJOVEビデオ出版物を参照してください）を評価します。体重変化を測定します。デジタルキャリパーと腸の長さと厚さを測定します。スツールテクスチャを（ハード、ソフトや血）に従ってください。 Hemooccultと便中の潜血を決定します。結腸組織を解剖し、H＆E染色のためにホルマリンで固定します。
- 1大腿boを解剖するね当たりマウスは、骨髄を抽出し、25G針と1mlシリンジ経由冷PBSで骨髄をフラッシュします。プール4骨髄は1管に差し込むと、氷の中に保管してください。
- 全く骨髄プラグが存在しなくなるまでペトリ皿、せん断18G針と5mlシリンジで数回骨髄プラグに骨髄を注ぐ。
- 4℃で5分間1500 rpmでスピンダウン上清を除去し、600μlの細胞染色バッファーで再懸濁する。 100μlで5エッペンドルフチューブ、それぞれに再懸濁させた骨髄を分ける。
7。フローサイトメトリーによる骨髄移植の品質検査
- 血液や骨髄＃1-5の各サンプルチューブにラベルを付ける：
- 暗闇の中で、それぞれの管のための抗体混合物を準備します。
第1抗体なし
第230μlのFITCアイソタイプコントロール+30μlのPEのアイソタイプコントロール+15μlのCD16/32ブロッキング
第330μlのFITC CD45.1 AB +15μlのCD16/32ブロッキング
＃4を30μlのPECD45.2 AB +15μlのCD16/32ブロッキング
第530μlのFITC CD45.1 AB +30μlのPE CD45.2 AB +15μlのCD16/32ブロッキング
| 血液や骨髄のサンプル＃1には何も追加しない |
| 各血液または骨髄サンプル＃2への抗体混合物＃25μlを追加 |
| 各血液または骨髄サンプル＃3に抗体混合物＃3の3μlを加え |
| 各血液または骨髄サンプル＃4に抗体混合第43μlを追加 |
| 各血液または骨髄サンプル＃5への抗体混合物＃5μlを加え |
- 30分間氷上で、暗所で保管してください。
- 各チューブに2ミリリットル1X RBC溶解バッファーを追加します。氷上で15分間、暗所で保管してください。
- 4℃で5分間、1500rpmで細胞をスピンダウン（GH 3.8ローター、1,500回転= 350×g）で上清を除去します。暗い、その後渦簡潔で500μlの細胞染色バッファーでペレットを再懸濁します。 フローサイトメトリーによる免疫染色された血液や骨髄サンプルでCD45.1（WTを表す）とCD45.2を（KOを表す）を確認してください。 KO CD45.2を表すために、WT CD45.1とPEを表すためにFITCを選択します。
- FlowJoソフトウェアによってフローサイトメトリーの結果を分析します。ドナーの遺伝子型は、血液や骨髄中の支配的な遺伝子型であるかどうかを判断するのFITC比：PEの比、またはPE：FITCの比率を計算します。
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Representative Results
目的遺伝子は、大腸炎の開発の間に免疫細胞で重要な役割を果たしている場合には、骨髄を介して異なる遺伝子型の骨髄を受けたマウスは、移植（KOまたはKOにWTとWTは）DSS大腸炎への応答変化があるはずです。大腸炎の重症度を決定するための最も重要なパラメータの1つは、結腸組織のH＆E染色である。結腸組織構造の変化や炎症の徴候を定量的に、H＆E組織像のスコアリングシステムで評価することができる。 DSS大腸炎モデルのため、H＆E組織像のスコアの基準は、ここに2を発見することができます。あるいは、化学物質誘発性大腸炎はまた、ニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によって誘導することができる。 TNBS腸炎誘導し、H＆E組織学採点基準の方法は前の刊行物3に記載されています。グループ間の組織学的スコアの差はスチューデントの t-検定により分析することができる。
マウスはかなり持っているかもしれ改善または偽骨髄移植（WTまたはKOにKOにWT）を持つマウスと比較した場合、大腸炎を悪化させた。目的遺伝子は、骨髄由来細胞を介して大腸炎において重要な役割を果たしている場合は、交換された骨髄を有するマウスは、偽の骨髄移植したマウスと大幅に異なる応答する必要があります。
のDSS大腸炎モデルでは、組織学的変化（ 図4を参照）の組織学的スコアによって評価することができる。組織学的スコアの有意な変化は、骨髄由来の細胞における目的遺伝子によって媒介される大腸炎の発展を示している場合があります。例えば、カセリシジンは抗菌·抗炎症ペプチド遺伝子（私たちの場合は目的遺伝子）は4です。骨髄移植せず、カテリシジンKOマウスは、一般的に野生型マウスは、DSSに対応していたよりも悪い大腸炎を開発しました。 transfusiながらカテリシジンノックアウト（KO）マウスと野生型（WT）骨髄の輸血は改善した大腸炎につながるカテリシジンノックアウト（KO）マウスから（WT）は、野生型マウスに骨髄の上には、DSS（ 図2）にさらされたときに大腸炎を悪化につながる。
目的遺伝子の発現を確認するためには、ドナー野生型骨髄から目的遺伝子のmRNA発現（ 例えば 。カテリシジン）骨後カテリシジン欠損ノックアウトレシピエントマウスの結腸（または他の）組織において検出可能でなければなりません骨髄移植。それはまた、野生型レシピエントマウスにおける目的遺伝子の発現がノックアウトマウスの骨髄の寄付後に減少しているかどうかを知ることは興味深い。
ドナー骨髄の生着の成功は、末梢血液細胞とレシピエントマウスの骨髄の両方で受信者のCDアイソタイプ以上ドナーのCDアイソタイプの支配的な割合で表されます。骨髄は血液が染色されていない細胞（ 図2および3）をたくさん持っているように最高のフローサイトメトリーでCD45.1とCD45.2の標識を示しています。
図1。骨髄移植の実験プロトコル。
図2。骨髄移植後のレシピエントマウスの骨髄のフローサイトメトリーデータ、Y軸はCD45.1信号FITC標識とX軸がPE標識CD45.2信号を展覧。正常な骨移植はレシピエントマウスの骨髄や血液の両方でCD45.1またはCD45.2遺伝子型の変化によって定義されます。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図3。骨髄移植後のレシピエントマウスの血のフローサイトメトリーデータは Y軸がCD45.1信号とX軸はCD45.2信号PE標識示しFITC標識を示しています。正常な骨移植はレシピエントマウスの骨髄や血液の両方でCD45.1またはCD45.2遺伝子型の変化によって定義されます。 拡大図を表示するにはここをクリック 。
図4。骨髄移植後のマウスにおける大腸炎の評価。nの（）サンプルコロンのH＆Eイメージをormal組織学およびDSS大腸炎。 （B）は組織学スコア。 DSS大腸炎の誘導が成功したDSS処理の5日目での組織学的スコアの有意な増加によって確認することができる。異なる遺伝子型に骨髄の交換の後、組織学的スコアは大幅に変更する必要があります。これは、骨髄由来細胞で発現する遺伝子の関心によって大腸炎の改変されたコースを提案します。データは平均値の平均値±標準誤差で表されます。
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Discussion
この骨髄移植のアプローチは、大腸炎の免疫学研究、感染症、癌、肥満や他の病気のために適している。この骨髄移植実験は、目的遺伝子が両方の骨髄由来と非骨髄由来細胞と目的遺伝子がいずれの集団からの細胞によって病気を媒介することが疑われるで発現した場合に必要とされる。例えば、抗菌ペプチドカテリシジンは、急性大腸炎を調節することが示されている。しかし、それは、上皮細胞や免疫細胞（マクロファージなど）の両方で表されます。その後、我々はマウスの急性大腸炎を調節する細胞のどの集団を定義するために骨移植を使用していました。大腸炎の重症度が有意に骨髄移植を介した骨髄カテリシジン遺伝子型の変更後に変更されていました。その後、我々は、DSSに対応して変調急性大腸炎に重要な役割を果たしている骨髄由来細胞で発現したカテリシジンを締結することができます。
骨ミリアンペアrrow由来の細胞は、典型的には赤血球、白血球、血小板が含まれています。骨髄移植は、これらの細胞ではなく、他の遺伝子型を変更します。横方向に言えば、この実験は、非骨髄由来の細胞に対する骨髄由来細胞における目的遺伝子の役割を区別することができます。しかし、この実験では、さらに、すべての赤血球、白血球、血小板などの大腸炎は骨髄由来である骨髄のどの集団由来の細胞を仲介定義することはできません。炎中にコロンに移行骨髄由来細胞の運命が活発に研究と論争の領域です。骨髄移植およびマウス大腸炎の誘導後に、骨髄由来細胞のいくつかはコロン5のリンパ系細胞および線維芽細胞として存在している可能性があります。別の報告では、骨髄由来細胞は回復過程6の血管新生のための内皮前駆細胞として働くことが示唆された。またevidencあり骨髄由来の細胞を示すeが7大腸炎患者における上皮細胞分化に関連付けられています。我々は、骨髄由来の細胞のいくつかは典型的な免疫細胞以外の細胞に分化し、大腸炎開発における変調の役割を果たしている可能性があるという可能性を除外することはできません。それにもかかわらず、骨髄由来マクロファージ/単球集団は、化学物質誘発性結腸粘膜損傷8,9に対する保護のために重要である。このレポートは、私たちがカセリシジンは単球/マクロファージ4から分泌されている間骨髄由来細胞から発現カテリシジンがDSS大腸炎を調節することを見つけることと整合的である。
一方、骨髄移植の成功を追跡するための多くの方法があります。 CD45.1とCD45.2遺伝子型のフローサイトメトリー分析は、レシピエントマウスにおけるドナー骨髄幹細胞由来の細胞の割合を決定するために定量的な方法を提供することができる。骨髄細胞に由来するsは、セル10、複数の種類に分化することができる。フローサイトメトリー分析が可能でない場合には、オス（XY染色体）ドナーマウスと11のメス（XXの染色体）レシピエントマウスを使用することも可能です。ドナーマウスはXXのみ女性レシピエントマウスの体内でユニークなY染色体を運ぶでしょう。 Y染色体は 、in situハイブリダイゼーションの11 中の蛍光によって同定することができる。さらに、CD45.1、CD45.2および/または組織における目的遺伝子の免疫組織化学は、ドナーの骨髄由来細胞を可視化する必要があるかもしれません。
マウスを屠殺した後、しかし、in situハイブリダイゼーションの手順の CD45をフローサイトメトリー解析とY染色体は、通常行われています。マウスを犠牲にすることなく、がんなどの慢性疾患を研究するために使用されているレシピエントマウスにおけるドナー細胞の位置を監視するためには、ドナーマウス12として緑色蛍光タンパク質トランスジェニックマウスを使用することも可能です。したがって、ドナー骨市場行由来の細胞が一過麻酔下で非侵襲的な高分解能光学イメージング下レシピエントマウスの体内で追跡することができ、これを繰り返し行うことができます。
すべてのマウスは、正常骨髄の移植13を持っていない。我々は、観測された〜マウスの10〜20％が貧血や感染症に起因する照射後の最初の2週間で死ぬ。したがって、必要以上のマウスは実験開始時に準備する必要があります。あなたは大腸炎の実験の最後にグループごとに8匹のマウスが使用可能に予想される場合には、実験開始時に各群10匹のマウスを準備する必要があります。また、できるだけ早く死亡したマウスを削除していることを確認します。免疫再構築の速度は、レシピエントマウス14に注入骨髄中の造血幹細胞の数と相関している。したがって、それは成功した骨髄TRのレシピエントマウスに注入ライブ骨髄細胞（マウス1匹あたり1×10 7細胞）の十分な数を持っていることが非常に重要ですansplantation。
照射後のレシピエントマウスは免疫を妥協しました。ドナーマウスの解剖や骨髄の準備の手順は、細胞培養実験と同じ基準で行われるべきです。滅菌器や容器の使用、無菌処理のテクニックを適用する必要があります。すべての実験を通して、PBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび10 U / mlのヘパリンは、骨髄の処理中に使用されるべきであるが含まれています。全ての試薬は、細胞培養グレードです。追加の技術的な議論は、参考文献13に記載されています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）-CUREセンター、クローン病とアメリカのキャリア開発賞（＃2691）と健康NIDDK K01研究所（DK084256）本町ワイクーンへの資金の大腸炎財団からパイロットとフィージビリティスタディの助成金によって賄われていた。
骨髄照射操作がバーナード·レヴィンとエイズ研究ヒト/マウスキメラ中核施設のためのUCLAのセンターのスコット·キッチンの援助を受けた。フローサイトメトリー操作はUCLAのベクトル·コア施設によって支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
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