Summary
La greffe de moelle osseuse fournit un moyen de changer le génotype des cellules de moelle osseuse dérivées. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et les cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés, la greffe de moelle osseuse peut modifier les cellules de moelle osseuse provenant d'un génotype différent sans modifier le génotype non-cellulaire de la moelle osseuse extraite.
Abstract
Pour comprendre le rôle d'un gène dans le développement de la colite, nous avons comparé les réponses des souris de type sauvage et sur les gènes d'intérêts souris knockout déficientes à la colite. Si le gène d'intérêt est exprimé dans les deux cellules de moelle osseuse et de cellules dérivées de moelle osseuse non dérivés de l'hôte, mais il est possible de différencier le rôle d'un gène d'intérêt dans des cellules de moelle osseuse dérivées et non de la moelle osseuse des cellules dérivées de la technique de transplantation de moelle osseuse. Pour changer la moelle osseuse de cellules dérivées du génotype des souris, la moelle osseuse d'origine des souris receveuses ont été détruites par l'irradiation, puis remplacé par un nouvel os moelle du donneur du génotype différent. Lorsque de type sauvage moelle osseuse du donneur souris a été transplanté à des souris knock-out, nous avons pu générer des souris knock-out avec l'expression du gène de type sauvage dans des cellules de moelle osseuse dérivées. Alternativement, lorsque les souris knock-out moelle osseuse du donneur a été transplanté à des souris de type sauvage bénéficiaires, souris de type sauvage sans gène d'intérêt exprimantde la moelle osseuse des cellules dérivées ont été produites. Cependant, la greffe de moelle osseuse peut ne pas être 100% complet. Par conséquent, nous avons utilisé cluster de différenciation (CD) molécules (CD45.1 et CD45.2) comme marqueurs de cellules du donneur et du receveur de suivi de la proportion de cellules de moelle osseuse du donneur provenant de souris receveuses et la réussite de la greffe de moelle osseuse. Souris de type sauvage avec des souris knock-out et génotype CD45.1 avec CD45.2 génotype ont été utilisés. Après l'irradiation des souris receveuses, les cellules du donneur de moelle osseuse de différents génotypes ont été infusée dans les souris receveuses. Lorsque la moelle osseuse nouvelle régénérée pour reprendre son immunité, les souris ont été provoquées par un agent chimique (sulfate de sodium dextrane, le MAS 5%) pour induire une colite. Ici, nous avons également montré la méthode pour induire une colite chez la souris et d'évaluer le rôle du gène d'intérêt exprimé à partir de la moelle osseuse des cellules dérivées. Si le gène d'intérêt dans les cellules osseuses dérivées joue un rôle important dans le développement de la maladie (comme Escherichiatis), le phénotype des souris receveuses avec greffe de moelle osseuse peut être significativement modifiée. À la fin des expériences colite, la moelle osseuse de cellules dérivées dans le sang et la moelle osseuse ont été marquées avec des anticorps contre CD45.1 et CD45.2 et leur rapport quantitatif de l'existence pourrait être utilisée pour évaluer la réussite de la greffe de moelle osseuse par cytométrie en flux. Succès de la transplantation de moelle osseuse doit montrer une grande majorité de génotype donneur (en terme de marqueur molécule CD) sur le génotype destinataire à la fois dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses.
Protocol
1. Avant-vous-start Considérations techniques
- Nous vous recommandons d'utiliser les deux C57/BL6 souris de type sauvage et des souris knock-out pour l'expérience parce que les souris avec des molécules CD correspondantes peuvent être achetés auprès de fournisseurs majeurs de souris.
- Comme il est difficile de suivre les souris de type sauvage et des souris knock-out dérivées des cellules du donneur après transplantation de moelle osseuse, il est nécessaire d'utiliser des souris CD45.1 pour représenter souris de type sauvage. (CD45.1 C57/SJL WT souris Jackson Laboratories stock # 002014).
- La plupart des colonies de souris sont CD45.2. Nos souris knock-out appartiennent à CD45.2 génotype (encore un CD45.2 source de souris WT: Jackson Laboratories stock # 000664). La détermination du génotype CD45.1 ou CD45.2 peut être effectuée en utilisant la cytométrie en flux de moelle osseuse et le sang périphérique tel que mentionné à l'article 7 du présent protocole.
- Souris après irradiation ont un système immunitaire fragilisé. Gardez souris dans usine exempte de pathogène.
- Opération de irradiateur nécessite spécial de sécurité clearance et de la formation. Pour gagner du temps dans les processus de formation et d'agrément, il est préférable de collaborer avec un laboratoire technicien qualifié qui est en mesure d'opérer l'irradiateur.
- De nombreuses institutions ont des laboratoires de cytométrie de flux avec des techniciens expérimentés. Afin de minimiser les problèmes de fonctionnement cytométrie en flux, il est préférable de discuter de votre plan d'expérience cytométrie de flux avec le technicien expérimenté avant de commencer.
- Les souris ont été affectés de cette manière (10 souris par groupe):
| Groupe | Donneur de moelle osseuse au destinataire | Traitement | |
| A | BM échange | WT CD45.1 à CD45.2 KO | DSS colite |
| B | Maîtrise de l'eau normale | ||
| C | BM échange | CD45.2 KO à CD45.1 WT | DSS colite |
| D | Maîtrise de l'eau normale | ||
| E | Comédie | CD45.1 WT à WT CD45.1 | DSS colite |
| Fa | Maîtrise de l'eau normale | ||
| Sol | Comédie | CD45.2 KO KO CD45.2 | DSS colite |
| H | Maîtrise de l'eau normale |
* Une brève illustration du protocole expérimental est représenté sur la figure 1.
2. Bénéficiaire souris irradiation
- Les souris sont élevés et maintenus exempts d'organismes pathogènes dans l'installation. Placez la souris à tarte irradiation autoclave avec filtre. Placer une souris dans chaque fente de tarte irradiation. Placez la tarte dans l'irradiateur et assurez-vous que le plateau tournant et se tournent tarte.
- Mettez la pompe à airpour la ventilation. Fermez la porte d'irradiation et le verrouiller.
- Irradier les souris avec 1.000 rad (ce qui équivaut à 10 Gy) environ 10 min (selon la source de rayonnement et la demi-vie). De ce point du temps, les souris irradiées sont immuno-déprimés et ont leur faible immunité contre l'infection. Après irradiation, prendre la tarte et placer dans un contenant stérile pour le transport d'enceinte de sécurité biologique dans l'animalerie. Évitez d'exposer les souris à l'environnement externe pour réduire les risques d'infection.
- En enceinte de sécurité biologique, de transférer les souris dans des cages de souris autoclave autoclave avec literie (4 souris par cage Ajouter une nouvelle eau stérile avec suspension Sulfatrim -. 3,12 ml par 100 ml d'eau).
- Envelopper la bouteille d'eau avec du papier aluminium que les antibiotiques sont sensibles à la lumière. Secouez pour mélanger le flacon de solution Sulfatrim avant de la charger dans la cage.
3. Extraction Os Marrow Donor
- Sacrifier des souris avec du dioxyde de carbone ou isoflurment et puis plonger dans la solution de Lysol 1:200. Vaporiser les souris avec de l'éthanol à 70% pour mouiller la peau et les os disséquer ouverts.
- Faire tremper les instruments de dissection dans l'éthanol à 70% pour la stérilisation.
- La dissection dans une enceinte de sécurité biologique. Utiliser les instruments de dissection stériles pour exposer l'humérus, le fémur, le tibia et du péroné os, libre de se fixer des muscles et des ligaments.
- Couper les deux extrémités des os pour montrer la moelle osseuse rouge. Maintenir les os avec une pince. Rincer la moelle osseuse rouge avec du PBS froid avec une seringue de 3 ml et des aiguilles de 25 G sur une boîte de Pétri. Rincer à partir des deux extrémités des os pour obtenir des cellules de moelle osseuse plus.
- Utilisez 6 seringues ml et 18G1 / 2 aiguilles pour briser les bouchons rouges par la moelle osseuse des ponctions répétées et d'éjection. Transfert de moelle osseuse avec tubes Falcon de 50 ml.
- Faites tourner la moelle osseuse dans 1800 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant, resuspendre le culot par vortex pendant 5-10 secondes.
- Diluer 10X tampon de lyse RBC avec de l'eau stérile. Annonced 1X tampon de lyse des globules rouges (5 ml par souris donneuse), vortex à nouveau pendant 5 sec et garder exactement 3 min à température ambiante.
- Après 3 minutes, remplir les tubes avec 20 ml de PBS froid pour arrêter la lyse et mélanger. Verser le contenu dans une passoire cellule 40 um directement dans un nouveau tube Falcon de 50 ml.
- Rincer les tubes d'origine avec 5 ml de PBS et transférer à tamis cellulaire ainsi. Compléter à 50 ml avec du PBS et mélanger.
4. Compter les cellules donneurs de moelle osseuse
- Ajouter 100 ul de bleu trypan dans un tube Eppendorf et 100 pi de suspension de moelle osseuse dans un tube Eppendorf et mélanger. Introduire à la pipette le mélange de cellules colorées à un hémocytomètre.
- La quantité de cellules est calculé en nombre d'os habitable totale de moelle de cellules dans des tubes Falcon = nombre de cellules non colorées en 16 carrés x 2 (en raison de bleu trypan dilution) x 10.000 x 50 ml
- Centrifuger les cellules de moelle osseuse de tubes Falcon de 50 ml à 2.000 tours par minute pendant 5 min à 4 ° C.
- Enlever le surnageant. Basésur les numérations cellulaires totales, remettre en suspension le culot dans du PBS à 1 x 10 8 cellules par ml
5. Infusion de souris receveuses
- Réchauffez les souris receveuses sur un pad thermique et sous une lampe chauffante. Mettez les souris receveuses dans restrainer. Injecter 1 x 10 7 cellules par souris dans 100-200 ul par voie intraveineuse.
- L'injection de moelle osseuse du donneur doit être effectuée entre 4-24 heures après l'irradiation.
- Restez à 4 souris injectées par cage. Maintenir les souris receveuses injectés dans des cages en autoclave avec de l'eau traitée par les antibiotiques pour les 4 premières semaines de l'animalerie exempte de pathogènes et de laisser les souris reprendre l'immunité. Changement des cages, traités aux antibiotiques eau et de la nourriture tous les 4 jours pour maintenir l'hygiène.
6. L'induction de la colite et de l'évaluation de la colite
- 4 semaines après la greffe de moelle osseuse et d'irradiation, passer à l'eau ordinaire, sans antibiotiques et maintenir la souris pour 2 semaines de plus pour reprendre leurs activités normalesflore microbienne intestinale.
- 6 semaines après l'injection de moelle osseuse, de mesurer le poids corporel initial. Certaines souris sont donnés 5% de sulfate de dextrane à boire l'eau ad libitum pour induire la colite. Certaines souris reçoivent de l'eau potable régulier seulement que les groupes de contrôle normaux.
- 5 jours plus tard, retirer le sang périphérique, transfert à l'héparine tubes revêtus (Vacutainer) et conserver dans la glace. Piscine du sang à partir de 4 souris à 1 tube. Mélanger 300 ul de sang avec 300 pi de tampon de coloration cellulaire = 600 pi. Diviser le sang de 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi.
- Sacrifier les souris avec du dioxyde de carbone ou de l'isoflurane. Évaluer les scores des dommages macroscopiques (s'il vous plaît se référer à une autre publication JOVE vidéo pour plus de détails 1). Mesurer changement de poids corporel. Longueur et l'épaisseur de l'intestin mesure avec pied à coulisse numérique. Observez la texture des selles (dur, mou ou sanglante). Déterminer sang occulte dans les selles avec Hemooccult. Disséquer les tissus du côlon et de fixer dans le formol pour H & E coloration.
- Disséquer une bo fémurne par souris, extraire la moelle osseuse et rincer la moelle osseuse avec du PBS froid via une aiguille 25G et seringue de 1 ml. Moelle osseuse Poule 4 bouchons pour 1 tube et garder dans la glace.
- Verser la moelle osseuse à une boîte de Pétri, la prise de cisaillement moelle osseuse avec une aiguille 18G et 5 fois la seringue jusqu'à plusieurs ml sans prise de moelle osseuse est présente.
- Isoler avec 1500 rpm pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension avec 600 ul de tampon de cellule coloration. Diviser la moelle osseuse remis en suspension à 5 tubes Eppendorf, chacun avec 100 pi.
7. Contrôle de qualité de la transplantation de moelle osseuse par cytométrie en flux
- Étiquetez chaque tubes de prélèvement de sang ou de moelle osseuse # 1-5:
- Préparer le mélange d'anticorps pour chaque tube respectif dans l'obscurité.
N ° 1 Aucun anticorps
# 2 30 ul de contrôle isotype FITC + 30 pl PE isotype contrôle + 15 pl CD16/32 blocage
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 pl CD16/32 blocage
# 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage
# 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 pl CD16/32 blocage
| Ajouter à rien échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 1 |
| Ajouter 5 ul de mélange d'anticorps n ° 2 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 2 |
| Ajouter 3 pi de mélange d'anticorps n ° 3 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 3 |
| Ajouter 3 pi de mélange d'anticorps n ° 4 à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 4 |
| Ajouter 5 ul de N ° 5 mélange d'anticorps à chaque échantillon de sang ou de moelle osseuse n ° 5 |
- Gardez à l'foncée de la glace pendant 30 min.
- Ajouter 2 ml de tampon de lyse 1X RBC dans chaque tube. Conserver dans l'obscurité sur la glace pendant 15 min.
- Centrifuger les cellules à 1500 rpm, 5 min à 4 ° C. (GH 3.8 rotor, 1500 rpm = 350 xg) Retirer le surnageant. Reprendre le culot avec 500 ul de tampon de cellule coloration dans l'obscurité, puis brièvement vortex. Vérifier la CD45.1 (représentant WT) et CD45.2 (représentant KO) dans le sang et immunocolorées échantillons de moelle osseuse par cytométrie de flux. Sélectionnez FITC pour représenter WT CD45.1 et PE pour représenter KO CD45.2.
- Analyser les résultats de cytométrie en flux par le logiciel FlowJo. Calculer le rapport de FITC: PE ou PE rapport: rapport FITC pour déterminer si le génotype donneur est génotype dominant dans le sang et la moelle osseuse.
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Representative Results
Si le gène d'intérêt joue un rôle important dans les cellules immunitaires au cours du développement de la colite, les souris recevant la moelle osseuse de génotype différent par greffe de moelle osseuse (WT KO ou KO à WT) devrait avoir une altération de la réponse à la colite DSS. L'un des paramètres les plus importants pour déterminer la gravité de la colite est la coloration H & E des tissus coliques. Changements dans la structure des tissus du côlon et des signes d'inflammation peut être évaluée quantitativement par H & E score histologique. Critères pour H & E histologie score pour modèle de colite DSS peut trouver ici 2. Alternativement, chimiques colite induite peut aussi être induite par l'acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS). Méthodes d'induction de colite par le TNBS et les critères de notation H & E histologie peut être trouvée dans une publication précédente 3. Différence entre les groupes score histologique peut être analysé par étudiant t-tests.
Les souris peuvent avoir sensiblementamélioré ou aggravé la colite par rapport à des souris atteintes imposture greffe de moelle osseuse (WT à WT ou KO KO). Si le gène d'intérêt joue un rôle important dans la colite via des cellules de moelle osseuse dérivés, les souris atteintes de la moelle osseuse échangées doivent répondre significativement différente des souris avec une greffe de moelle osseuse imposture.
Pour le modèle de colite DSS, le changement histologie peut être évaluée par un score histologique (voir Figure 4). Changement significatif de score histologique peut indiquer le développement de la colite médiée par le gène d'intérêt dans les cellules de moelle osseuse dérivées. Par exemple, cathélicidine est un gène de peptide anti-microbien et anti-inflammatoires (gène d'intérêt dans notre cas) 4. Sans greffe de moelle osseuse, cathélicidine souris KO généralement développés pire que la colite souris de type sauvage a fait en réponse au MAS. La transfusion de type sauvage moelle osseuse (WT) à élimination directe cathélicidine (KO) des souris conduit à la colite améliorée tout en transfusisur la moelle osseuse de cathélicidine KO (KO) des souris à des souris de type sauvage (WT) conduit à la colite aggravée lorsqu'elle est exposée au MAS (Figure 2).
Pour vérifier l'expression du gène d'intérêt, expression de l'ARNm du gène d'intérêt (p. ex. Cathélicidine) de la moelle osseuse du donneur de type sauvage devraient être détectables dans les coliques (ou autre) des tissus cathélicidine souris déficientes en huitièmes de finale après osseuse bénéficiaires La greffe de moelle. Il est également intéressant de savoir si l'expression du gène d'intérêt chez les souris de type sauvage bénéficiaires est réduit après le don de moelle des souris knock-out os.
Prise de greffe réussie de moelle osseuse du donneur est représenté par le rapport dominant du donneur CD isotype sur CD isotype destinataire dans les deux cellules du sang périphérique et la moelle osseuse des souris receveuses. La moelle osseuse montre mieux l'étiquetage des CD45.1 et CD45.2 en cytométrie en flux de sang a beaucoup de cellules non colorées (Figure 2 et 3).
Figure 1. Le protocole expérimental de greffe de moelle osseuse.
Figure 2. Données de cytométrie en flux de moelle osseuse de souris receveuses après greffe de moelle osseuse. L'axe des ordonnées indique marqué au FITC CD45.1 signal et l'axe des X montre PE marqué CD45.2 signal. Greffe osseuse réussie est définie par le changement de CD45.1 ou CD45.2 génotype dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Données de cytométrie en flux de sang des souris receveuses après greffe de moelle osseuse. L'axe des ordonnées indique marqué au FITC CD45.1 signal et l'axe des X montre PE marqué CD45.2 signal. Greffe osseuse réussie est définie par le changement de CD45.1 ou CD45.2 génotype dans la moelle osseuse et le sang des souris receveuses. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Évaluation de la colite chez la souris après transplantation de moelle osseuse. L'échantillon (A) H & E des images de deux points avec normal histologie et la colite DSS. (B) les scores histologiques. L'induction de la colite DSS succès peut être confirmé par l'augmentation significative du score histologique au jour 5 de traitement DSS. Après l'échange de moelle osseuse à génotype différent, le score histologique doit changer de façon significative. Ceci suggère que le cours altération de la colite par le gène d'intérêt exprimé dans les cellules de moelle osseuse dérivées. Les données sont représentées par la moyenne ± erreur type de la moyenne.
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Discussion
Cette approche greffe de moelle osseuse est adapté à la recherche d'immunologie de la colite, une infection, le cancer, l'obésité et d'autres maladies. Cette expérience greffe de moelle osseuse est nécessaire lorsque le gène d'intérêt est exprimé à la fois dans la moelle osseuse dérivées et les cellules de moelle osseuse non dérivés et le gène d'intérêt est soupçonnée de servir de médiateur maladie par les cellules de la population soit. Par exemple, peptide antimicrobien cathélicidine est montré à moduler la colite aiguë. Mais il est exprimé dans les deux cellules épithéliales et des cellules immunitaires (comme les macrophages). Ensuite, nous avons utilisé la transplantation osseuse pour définir de quelle population de cellules modulent la colite aiguë chez la souris. La gravité colite a été considérablement modifié après le changement de l'os génotypes cathélicidine moelle par greffe de moelle osseuse. Ensuite, nous pouvons conclure que cathélicidine exprimée dans les cellules de moelle osseuse provenant joue un rôle important dans la modulation de la colite aiguë en réponse au MAS.
Os mades cellules dérivées rrow comprennent généralement les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. La greffe de moelle osseuse change le génotype de ces cellules mais pas d'autres. Latéralement parlant, cette expérience ne peut différencier le rôle du gène d'intérêt dans les cellules de moelle osseuse provenant par rapport aux non-moelle osseuse des cellules dérivées. Mais cette expérience ne peut mieux définir de quelle population de moelle osseuse provenant de médiateur cellules de la colite comme tous les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes sont dérivées de la moelle osseuse. Le sort des cellules de moelle osseuse provenant migré vers deux points au cours de la colite est une zone active et controversé de la recherche. Après une greffe de moelle osseuse et l'induction de la colite murine, il est probable que certaines des cellules de moelle osseuse provenant exister en tant que cellules lymphoïdes et les myofibroblastes dans le deux-points 5. Un autre rapport a suggéré que les cellules de moelle osseuse provenant servir de cellules progénitrices endothéliales de la néovascularisation dans 6 processus de récupération. Il ya aussi evidence montrant des cellules dérivées de moelle osseuse sont associés à la différenciation des cellules épithéliales chez les patients atteints de colite 7. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que certaines des cellules de moelle osseuse dérivées peuvent différencier en cellules autres que les cellules immunitaires typiques et jouent un rôle dans le développement de la colite modulation. Néanmoins, la moelle osseuse provenant de monocytes / macrophages population est importante pour la protection contre les agents chimiques lésions de la muqueuse colique induite par 8,9. Ce rapport est conforme à notre constatation selon laquelle cathélicidine exprimé à partir de cellules de moelle osseuse provenant colite module SSD et cathélicidine est sécrétée par les monocytes / macrophages 4.
D'autre part, il existe de nombreuses façons de mesurer le succès de la greffe de moelle osseuse. L'analyse par cytométrie de flux de CD45.1 et CD45.2 génotypes peuvent fournir une méthode quantitative pour déterminer la proportion de cellules du donneur de moelle osseuse de cellules souches dérivées des souris receveuses. Dérivée de cellules de moelle osseuses peuvent se différencier en plusieurs types de cellules 10. Lorsque l'analyse par cytométrie en flux n'est pas réalisable, il est possible d'utiliser des souris mâles (XY donateurs chromosome) et femelles souris bénéficiaires (chromosome XX) 11. Les souris donneuses portera chromosomes Y uniques dans le corps des souris XX bénéficiaires que les femmes. Chromosome Y peuvent être identifiées par hybridation in situ fluorescente 11. En outre, l'immunohistochimie de CD45.1, CD45.2 et / ou le gène d'intérêt dans les tissus peut être nécessaire pour visualiser les cellules du donneur de moelle osseuse dérivées.
Mais CD45 cytométrie en flux et du chromosome Y dans les procédures d'hybridation in situ sont généralement effectués après les souris ont été sacrifiées. Pour surveiller l'emplacement des cellules du donneur dans les souris receveuses utilisées pour étudier les maladies chroniques comme le cancer, sans sacrifier les souris, il est possible d'utiliser des souris vertes protéines fluorescentes transgéniques de 12 souris donneuses. Par conséquent, l'os donneur marcellules dérivées de ligne peuvent être suivis dans le corps des souris receveuses sous imagerie non invasive optique à haute résolution sous anesthésie transitoire, ce qui peut être fait à plusieurs reprises.
Pas toutes les souris ont la moelle osseuse succès de la transplantation 13. Nous avons observé ~ 10-20% des souris meurent dans les 2 premières semaines après l'irradiation due à l'anémie ou infection. Par conséquent, plus de souris que nécessaire devrait être prêt au début de l'expérience. Par exemple, vous devez préparer 10 souris par groupe au début de l'expérience, si vous vous attendez à 8 souris par groupe disponible à la fin de l'expérience, la colite. Aussi, assurez-vous d'enlever les souris mortes dès que possible. La vitesse de reconstitution immunitaire est corrélée au nombre de cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse perfusé dans les 14 souris receveuses. Par conséquent, il est crucial d'avoir un nombre suffisant de cellules vivantes de la moelle osseuse (1 x 10 7 cellules par souris) infusées dans des souris receveuses pour tr moelle osseuse réussieansplantation.
Les souris receveuses après irradiation ont un système immunitaire fragilisé. Donateurs souris dissection et procédures de la moelle osseuse de préparation doit être fait dans la même norme que les expériences de culture cellulaire. L'utilisation d'instruments stériles et les conteneurs, les techniques de manipulation aseptiques devraient être appliquées. Tout au long de toutes les expériences, PBS contenant 1% de pénicilline-streptomycine et 10 U / ml d'héparine doit être utilisé lors de la manipulation de courges os. Tous les réactifs sont de qualité culture cellulaire. Autres discussions techniques peuvent être trouvées dans la référence 13.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la subvention pilote et étude de faisabilité de l'UCLA-CURE Center, la maladie de Crohn et la colite Foundation of America Award de développement de carrière (# 2691) et l'Institut National de la Santé NIDDK K01 (DK084256) le financement à l'honorable Wai Koon.
Opération d'irradiation de la moelle osseuse a été aidé par Bernard Levin et cuisine Scott de l'UCLA Center for AIDS Research souris / humain installation de base Chimera. Opération de cytométrie en flux a été aidé par l'UCLA installation de base de vecteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 | |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 | |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 | |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 | |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 | |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 | |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) | |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 | |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II | |
| Flow cytometer test-tube | Falcon | #352052 | |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
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