Summary
Cellule tumorali circolanti sono isolate dal sangue di pazienti affetti da cancro senza infliggere danni cellulari. Isolamento di cellule tumorali viene eseguita utilizzando una superficie bimolecolare di E-selectina in aggiunta agli anticorpi contro marcatori epiteliali. Un rivestimento nanotubo favorisce espressamente adesione cellulare del cancro con conseguente purezze cattura elevate.
Abstract
Cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che diffondono da un tumore primario in tutto il sistema circolatorio e che può in ultima analisi, formare tumori secondari in siti distanti. CTC conteggio può essere utilizzata per seguire la progressione della malattia in base alla correlazione tra la concentrazione CTC nel sangue e gravità della malattia 1. Come strumento di trattamento, CTC potrebbe essere studiata in laboratorio per sviluppare terapie personalizzate. A tal fine, isolamento CTC deve provocare alcun danno cellulare, e la contaminazione da altri tipi cellulari, in particolare leucociti, deve essere evitato il più possibile 2. Molte delle tecniche attuali, tra cui l'unico dispositivo approvato dalla FDA per il conteggio CTC, distruggere CTC come parte del processo di isolamento (per maggiori informazioni vedi rif. 2). Un dispositivo microfluidico per catturare vitale CTC è descritto, costituito da una superficie funzionalizzata con E-selectina glicoproteina in aggiunta anticorpi contro marcatori epiteliali 3. Per migliorare prestazioni del dispositivomance un rivestimento di nanoparticelle è stato applicato costituito da nanotubi halloysite, un nanoparticelle alluminosilicato raccolto da argilla 4. Le E-selectina molecole forniscono un mezzo per catturare rapido movimento CTC che sono pompati attraverso il dispositivo, conferendo un vantaggio rispetto alle alternative dispositivi microfluidici cui tempi di trattamento più lunghi sono necessari per fornire cellule bersaglio con il tempo sufficiente per interagire con una superficie. Gli anticorpi a bersagli epiteliali fornire CTC-specificità al dispositivo, nonché fornire un parametro facilmente regolabile per sintonizzare isolamento. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite permette di isolare significativamente maggiore rispetto ad altre tecniche, contribuendo a catturare le cellule si muovono veloci, fornendo maggiore area di superficie per l'assorbimento delle proteine, e respingere leucociti contaminanti 3,4. Questo dispositivo è prodotto mediante una tecnica semplice utilizzando off the shelf materiali, ed è stata usata per catturare le cellule tumorali dal sangue di metastaticoPazienti con tumore. Cellule catturate vengono mantenute per un massimo di 15 giorni in coltura, previo isolamento, e questi campioni consistono tipicamente di> 50% delle cellule tumorali vitali primarie di ogni paziente. Questo dispositivo è stato usato per catturare vitali CTC sia da sangue intero diluito e campioni di buffy coat. In definitiva, vi presentiamo una tecnica con la funzionalità in ambito clinico per sviluppare terapie oncologiche personalizzate.
Protocol
Il protocollo seguito è per la produzione di un dispositivo microtubo singolo.
1. Preparazione della soluzione Nanotubi Halloysite
- Sottoporre ad ultrasuoni (10-13 W (rms)) 250 microlitri soluzione di nanotubi halloysite (6,6% in peso in acqua) 30 sec. Soluzione di raffreddare con acqua fredda e sonicazione ripetere una sola volta. Raffreddare di nuovo.
- Disegna la soluzione sonicato in una siringa, collegare un filtro per siringa 0,45 micron, e la soluzione di filtro in provetta per microcentrifuga pulita. Vortex la soluzione di tanto in tanto per mantenere l'omogeneità.
2. Rivestimento di superficie Conetti interno con nanotubi halloysite
- Ottenere 50 cm lungo tratto di Micro-Renathane microtubing (300 micron di diametro interno, 35,3 microlitri di volume interno). Tagliare un'estremità della provetta in diagonale e inserire in un piccolo pezzo adattatore IDEX. Inserire l'ago di una siringa 3/10 cc 29G nell'altra estremità della provetta.
- Per pulire la provetta, posizionare l'estremità aperta della provetta (finecon l'adattatore) in etanolo al 70% e il pareggio ~ 50 microlitri di etanolo nella siringa per riempire provetta.
- Sciacquare la produzione di etanolo da provetta disegnando un volume generoso di acqua distillata nella siringa.
- Staccare la siringa dal microprovetta, svuotare la siringa, e quindi ricollegare alla provetta.
- Preparare una soluzione di 0,02% w / v poli L-lisina in acqua. Disegnare 50 pl nella provetta e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Disegnare 100 ul di soluzione nanotubo filtrata nella provetta e consentire ad incubare per 3 minuti a RT.
- Disegnare 100 microlitri di acqua attraverso la provetta per sciacquare la soluzione nanotubo. Lasciare microprovetta rivestito di sedersi, riempita con acqua, durante la notte a temperatura ambiente.
3. Preparazione di Microtubes per l'isolamento cellulare
- Preparare una soluzione di 10 ug / mL proteina G in fosfato di Dulbecco 1X salina tamponata (PBS, pH 7,0 - 7,2). Disegnare 50 microlitri di PBS attraverso provetta e quindi disegnare 50 pl dila proteina-G soluzione e consentono di incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
- Preparare una soluzione contenente 5 pg / mL E-selectina-IgG e 50 ug / ml di anticorpo (anti-EpCAM per la maggior parte dei campioni di cancro, anti-PSMA per campioni di cancro della prostata) in PBS. Estrarre 50 pl della E-selectina e la soluzione di anticorpi nella provetta e permettono di incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Non specifica adesione cellulare è bloccato con le proteine del latte del 5%. Preparare una soluzione di 5% (w / v), proteine del latte in PBS. Estrarre 50 pl soluzione di proteina del latte nella provetta e consentire ad incubare per 1 ora a RT.
- Disegnare 50 microlitri di PBS nella provetta e lasciare a temperatura ambiente fino a quando i campioni di sangue o cappotto buffy sono pronti per l'elaborazione.
- 10 min prima di utilizzare il microprovetta per l'isolamento, disegnare 50 pl PBS che è stato saturato con Ca 2 + ("PBS +") per attivare le molecole selectina.
4. Preparazione dei campioni per l'isolamento delle cellule
- Disegnare o ottenere 10 mL di sangue dal paziente in eparinizzatotubo.
- Place 10 mL Ficoll-Paque soluzione di isolamento dei linfociti in tubo da 50 ml centrifuga. Delicatamente sangue intero strato 10 mL sopra Ficoll per non mescolare il sangue e Ficoll.
- Centrifugare a 2000x g per 15 min a 4 ° C con decelerazione minima.
- Rimuovere lo strato di rivestimento buffy e il luogo in nuova provetta.
- Lavare il buffy coat con PBS (centrifugare a 230x g per 10 min, scartare il surnatante).
- Risospendere delicatamente le cellule con 1 ml di tampone di lisi RBC e incubare per 10 min a RT per la lisi degli eritrociti.
- Aggiungere 10 ml di PBS, mescolare delicatamente e centrifugare a 230x g per 10 min. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 3 a 4 mL PBS +.
5. Cella di isolamento
- Collegare una estremità della provetta funzionalizzato ad una siringa da 5 ml con adattatori IDEX.
- Inserire la siringa su una pompa a siringa.
- Immergere l'estremità aperta della provetta funzionalizzato nella cella suspension.
- Elabora la sospensione cellulare attraverso la provetta a 1 a 4 mL / h.
- Trasferire l'estremità aperta della provetta in una provetta contenente PBS + 300 + e disegnare ul PBS nella siringa a 0,016 mL / min per rimuovere le cellule non legato e vagamente legate dalla provetta.
- Posizionare l'estremità aperta della provetta in una provetta pulita. Staccare la siringa dal microprovetta e allegare una siringa preriempita con Accutase. Delicatamente perfusione Accutase abbastanza in provetta da riempire (~ 50 mL) e lasciar incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Attaccare una siringa preriempita con 1 mL di mezzo di crescita (79% RPMI, FBS 20%, streptomicina 1% di penicillina) e profumato in provetta, raccogliendo effluente in coltura di tessuto trattati bene piastra.
- Cellule di coltura a 37 ° C e 5% CO 2 in condizioni umidificati.
6. Risultati rappresentativi
L'obiettivo di questa tecnica è quella di isolare cellule tumorali vitali dal sangue di pazienti affetti da cancro. Esistono diversi metodi per identificare le cellule tumorali in coltura, una verifica necessaria di successo dispositivo. Abbiamo scelto per colorare le cellule in coltura con anticorpi contro porzioni epiteliali come EpCAM (molecola di adesione cellulare epiteliale) o PSMA (antigene di membrana specifico della prostata), oltre a DAPI per identificare nuclei intatti cellule (Fig. 2 e 3). Il numero di cellule tumorali catturato utilizzando questa tecnica è necessariamente una funzione del numero di CTC nel campione iniziale, e la variabilità del paziente può essere elevato. Nel trattamento di campioni prelevati da pazienti con diagnosi di tumori stadio IV, che abitualmente catturano tra 100 e 500 cellule tumorali per provetta di sangue, a purezze> 50%. Immediatamente dopo isolamento, un maggior numero di leucociti contaminanti possono essere presenti. Tuttavia, questi numeri saranno esaurite incubazione seguente terreno di coltura per un massimo di 5 giorni.
Figura 2. Dati rappresentativi di isolamento CTC da campioni di sangue prelevato da un paziente cancro al seno e un malato di cancro ai polmoni. Il numero di cellule vitali identificabili come CTC base colorazione EpCAM è rappresentato dalle barre solide e riguardano l'ordinata di sinistra e la percentuale di cellule che sono stati identificati come CTC rispetto al numero totale di cellule catturate è rappresentato dalle barre aperte e misurato sulla ordinata di destra. I risultati vengono dopo cinque giorni di coltura. 
Micrografie rappresentativi Figura 3. Da donatori diversi (A e B) della CTC nella cultura 5 giorni successivi alla intercettaza partire da un campione di sangue del paziente cancro. Le cellule sono state colorate per fluorescenza con EpCAM AlexaFluor 488 (verde) e 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare il nucleo (blu).
Discussion
E 'spesso il caso che i primi passi nella scoperta di nuove terapie contro il cancro utilizzano linee di cellule tumorali, che somigliano discutibile per le cellule tumorali primarie pur rimanendo in uso a causa della loro facilità d'uso in laboratorio. La ricerca lo sviluppo di nuove terapie oncologiche sarebbe accelerato se primarie cellule tumorali umane sono state utilizzate prima nella ricerca romanzo. CTC sono il tipo più facilmente accessibile di cellule del cancro, a causa della loro presenza nel sangue e la facilità di un prelievo di sangue standard. Inoltre, cellule tumorali circolanti rappresentano un passo necessario nel processo di metastasi 5,6, quindi la loro rilevanza per la malattia e l'utilità per il targeting di nuovi farmaci è chiaro. Isolamento di CTC dal sangue in vitro è complicata dal loro basse concentrazioni: dell'ordine di uno per milione leucociti o uno per miliardo eritrociti 7. La maggior parte degli attuali metodi per la rilevazione CTC nel sangue, compreso l'unico approvato dalla FDA Cella tecnica Cerca (Veridex), danneggiare o distruggere le cellule nel processo di rilevamento, escludere l'utilizzo di là di enumerazione. Il metodo sopra descritto non compromette la vitalità cellulare e apre quindi la porta per la futura ricerca clinica sul cancro. Poiché il recupero di cellule intatte è l'obiettivo di questa tecnica, è imperativo che le cellule essere maneggiato con cura, in particolare durante le fasi di separazione sangue.
Ci sono un certo numero di parametri regolabili in questo sistema che possa essere modificato per ottenere una resa migliore a seconda delle caratteristiche critiche come tipo di cancro. Nelle fasi sopra descritte, abbiamo scelto di utilizzare EpCAM come CTC anticorpo specifico per tutti i tipi di cancro, tranne quando il trattamento di campioni di cancro della prostata, in cui anti-PSMA è stato usato. Altre sostituzioni di tumore-specifici anticorpi possono certamente essere utilizzato per migliorare le prestazioni per i singoli pazienti. Inoltre, le concentrazioni selectina e anticorpo può essere modificata per migliorare la cattura 8.
"> Una caratteristica essenziale del dispositivo è l'incorporazione di E-selectina molecole sulla superficie. E-selectina è normalmente espressa sulla superficie luminale delle cellule endoteliali e la funzione di assumere rapido movimento leucociti ai siti di infiammazione. Leucociti Flowing legano a transitoriamente molecole selectina, causando un più lento, comportamento a rotazione che facilita legame più lento e più forte della cella all'endotelio da integrine. convincente evidenza sperimentale esiste che rende il caso che CTC può travasare da un meccanismo simile 9,10. L'inclusione di selectina anche consente al dispositivo di funzionare a portate maggiori, aliquote che impedirebbero cellule di legarsi ad anticorpi 11. Così il dispositivo imita fisiologicamente uno venule per catturare biomimeticamente fluisce CTC senza causare danno cellulare.Prestazioni del dispositivo migliorato può essere attribuito al aggiunta del rivestimento nanotubo halloysite alla superficie luminaledel dispositivo. Studi precedenti hanno dimostrato che ci sono tre componenti principali del rivestimento nanotubi che permette una migliore funzionalità. In primo luogo, il rivestimento nanotubo fornisce una superficie maggiore, consentendo una maggiore deposizione di proteine sulla superficie 4. In secondo luogo, nell'esecuzione di microscopia a forza atomica sul rivestimento nanotubo abbiamo determinato che i singoli nanotubi sporgono dalla superficie nel flusso. Questo permette molecole selectina essere presentate come una delle molte micron dalla superficie in modo che le cellule possono essere catturato e assunti alla superficie anteriore nella loro traiettoria attraverso il tubo 4. Infine, il rivestimento nanotubo halloysite è in grado di prevenire l'adesione dei leucociti e la diffusione sulla superficie, consentendo un ridotto numero di leucociti catturati insieme al CTC e quindi una maggiore purezza successive CTC 3.
Disclosures
MRK è un consulente scientifico di CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Acknowledgments
Il lavoro descritto è stato sostenuto dal Centro Cornell sul microambiente e metastasi attraverso il numero di U54CA143876 Award dal National Cancer Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Cancer Institute e il National Institutes of Health. Questo lavoro è stato inoltre finanziato in parte da una National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
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