Summary
Cirkulerande tumörceller isolerades från blodet från patienter med cancer utan att vålla cellulär skada. Isolering av tumörceller åstadkommes med användning av en bimolekylär yta av E-selektin i tillägg till antikroppar mot epiteliala markörer. En nanotube beläggning gynnar speciellt vidhäftning cancercell resulterar i höga fånga renheter.
Abstract
Cirkulerande tumörceller (CTC) är celler som sprider från en primär tumör i hela det cirkulatoriska systemet och som kan slutligen bilda sekundära tumörer på avlägsna ställen. CTC räkna kan användas för att följa sjukdomens progression baserat på korrelationen mellan CTC koncentrationen i blodet och sjukdomens svårighetsgrad 1. Som en behandling verktyg, skulle CTC studeras i laboratorium för att utveckla personliga behandlingar. För detta ändamål måste CTC isolering orsakar någon cellulär skada och kontamination av andra celltyper, speciellt leukocyter, måste undvikas så mycket som möjligt 2. Många av de nuvarande tekniker, inklusive den enda FDA-godkända enhet för CTC räkning, förstöra CTC som en del av isoleringen processen (för mer information se ref. 2). En mikrofluidikanordning att fånga livskraftig CTC beskrivs, som består av en yta funktionaliserad med E-selektin glykoprotein förutom antikroppar mot epiteliala markörer 3. För att öka enhetens prestandaMance en nanopartikel applicerades bestående av halloysite nanorör, en aluminiumsilikat nanopartiklar skördas från lera 4. De E-selektinmolekyler vara ett sätt att fånga snabbrörliga CTC som pumpas genom enheten, låna en fördel jämfört med alternativa mikroflödessystem enheter där längre handläggningstider är nödvändiga för att målceller tillräckligt med tid att interagera med en yta. De antikroppar mot epitelceller mål ger CTC-specificitet till enheten, samt ge en lätt justerbar parameter för att ställa isolering. Slutligen tillåter halloysite nanotube beläggningen avsevärt förbättrad isolering i förhållande till andra tekniker genom att hjälpa att fånga snabbrörliga celler, vilket ger ökad yta för protein adsorption, och avvärja kontaminerande leukocyter 3,4. Denna anordning tillverkas genom en enkel teknik med användning off-the-shelf material, och har med framgång använts för att fånga cancerceller från blod av metastatiskcancerpatienter. Infångade cellerna bibehålls under upp till 15 dagar i odling efter isolering, och dessa prover består typiskt av> 50% viabla primära cancerceller från varje patient. Denna enhet har använts för att fånga livskraftig CTC från både utspätt helblod och buffy prover päls. I slutändan presenterar vi en teknik med funktionalitet i en klinisk miljö för att utveckla personliga cancerbehandlingar.
Protocol
Följande protokoll är att produktionen av en enda mikrorör enhet.
1. Framställning av halloysit Nanotube lösning
- Sonikat (10-13 W (RMS)) 250 iL halloysite nanorör lösning (6,6 vikt% i vatten) 30 sek. Cool lösning med kallt vatten och upprepa ultraljudsbehandling gång. Kyl igen.
- Rita sonikerad lösning i en spruta, bifoga en 0,45-filter m spruta och filtrera lösningen till rent mikrofugrör. Vortex lösningen då att upprätthålla homogenitet.
2. Beläggning av mikrorör insida med halloysite nanorör
- Skaffa 50 cm lång sektion av Micro-Renathane microtubing (300 m inre diameter, 35,3 il innervolym). Skär ena änden av mikrorör på en diagonal och infoga i en liten IDEX adapter pjäs. In nålen i en 3/10 cm ^ 29G spruta in den andra änden av mikrorör.
- För att rengöra mikrorör, placera den öppna änden av mikrorör (slutetmed adaptern) i 70% etanol och dra ~ 50 pl etanol i sprutan för att fylla mikrorör.
- Skölj etanolen ur mikrorör genom att dra en generös volym destillerat vatten i sprutan.
- Lossa sprutan från mikrorör, tömma sprutan, och sedan återansluta till mikrorör.
- Framställ en lösning av 0,02% vikt / volym poly-L lysin i vatten. Dra 50 pl in i mikrorör och låt stå under 5 min vid rumstemperatur (RT).
- Dra 100 | il filtrerades nanoröret lösning i mikrorör och tillåta att inkubera i 3 min vid rumstemperatur.
- Rita 100 xl vatten genom mikrorör för att skölja ur nanorör lösningen. Låt belagd mikrorör att sitta, fylld med vatten över natten vid RT.
3. Framställning av Mikrorör för cellisolering
- Framställ en lösning av 10 | ig / ml protein-G i 1 x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS, pH 7,0 - 7,2). Rita 50 pl PBS via mikrorör och sedan dra 50 ilden protein-G-lösning och tillåter att inkubera i 1,5 timmar vid rumstemperatur.
- Framställ en lösning innehållande 5 ug / ml E-selektin-IgG och 50 | ig / ml antikropp (anti-EpCAM för de flesta cancerpatienter prover, anti-PSMA för prostatacancer prover) i PBS. Dra 50 | il av E-selektin och antikroppslösningen till mikrorör och tillåta att inkubera under 2 h vid RT.
- Ospecifik cellulär adhesion blockerades med 5% mjölkprotein. Framställ en lösning av 5% (vikt / volym) mjölkprotein i PBS. Dra 50 | il lösning mjölkprotein i mikrorör och tillåta att inkubera under 1 h vid RT.
- Dra 50 | il PBS i röret och lämnar vid RT tills blod eller buffy coat prover är redo för bearbetning.
- 10 min före användning av mikrorör för isolering, dra 50 | il PBS som har mättats med Ca 2 + ("PBS +") för att aktivera selektinmolekyler.
4. Beredning av prover för cellisolering
- Rita eller skaffa 10 ml blod från patient hepariniseraderöret.
- Ställe 10 ml Ficoll-Paque lymfocytisolering lösningen i 50 ml centrifugrör. Försiktigt skiktet 10 ml helblod ovanpå Ficoll för att inte blanda blodet och Ficoll.
- Centrifugera vid 2000x g under 15 min vid 4 ° C med minimal retardation.
- Avlägsna lättcellskoncentratskiktet och placera i ett nytt rör.
- Tvätta buffy coat med PBS (centrifugera vid 230X g under 10 minuter, kasta supernatanten).
- Försiktigt återsuspendera cellerna med 1 ml RBC-lys-buffert och inkuberas under 10 min vid RT för att lysera erytrocyter.
- Tillsätt 10 ml PBS, blanda försiktigt och centrifugera vid 230X g under 10 minuter. Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 3 till 4 ml PBS +.
5. Cellisolering
- Fäst ena änden av funktionaliserade mikrorör till en 5 ml spruta med Idex adaptrar.
- Sätt sprutan på en sprutpump.
- Dränka den öppna änden av den funktionaliserade mikrorör i cellen suspension.
- Bearbeta cellsuspensionen genom mikrorör vid 1 till 4 ml / tim.
- Överföra den öppna änden av mikrorör till ett rör innehållande PBS + och dra 300 pl PBS + i sprutan vid 0,016 ml / min för att avlägsna obundet och löst bundna celler från mikrorör.
- Placera den öppna änden av mikrorör till ett rent rör. Koppla sprutan från mikrorör och bifoga en spruta förifyllda med Accutase. Försiktigt perfundera tillräckligt Accutase i mikrorör för att fylla (~ 50 | il) och tillåta att inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Fästa en spruta fylld i förväg med 1 ml av odlingsmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicillin streptomycin) och perfundera in mikrorör, uppsamling avloppsvatten i vävnadsodlingsbehandlade brunnar.
- Odlingsceller vid 37 ° C och 5% CO2 under fuktiga förhållanden.
6. Representativa resultat
Målet med denna teknik är att isolera viabla cancerceller från blod av cancerpatienter. Det finns flera metoder för att identifiera cancerceller i odling; en nödvändig kontroll av framgång för anordningen. Vi har valt att färga celler i odling med antikroppar mot epiteliala grupper såsom EpCAM (epitelialt cellulär adhesionsmolekyl) eller PSMA (prostataspecifikt membranantigen), förutom att DAPI för att identifiera intakt cellkärna (fig. 2 och 3). Antalet cancerceller tagits med denna teknik är nödvändigtvis en funktion av antalet CTCS i startelvan provet, och variabiliteten kan vara hög. I behandlingen prover som tagits från patienter som diagnostiserats med stadium IV cancer, fånga vi rutinmässigt mellan 100 och 500 cancerceller per rör av blod, på renhet> 50%. Omedelbart efter isolering, kan ett större antal kontaminerande leukocyter vara närvarande. Emellertid har dessa nummer kommer att utarmas efter inkubation i odlingsmedium under upp till 5 dagar.
Figur 2. Representativa data för CTC isolering från blodprover från en bröstcancerpatient och en lungcancer patienten. Antalet livsdugliga celler identifieras som CTC baserat på EpCAM färgning representeras av de fyllda staplarna och avser den vänstra ordinatan och den procentuella andelen celler som har identifierats som CTC jämfört med det totala antalet infångade celler representeras av de ej ifyllda staplarna och uppmätt på den högra ordinatan. Resultaten efter fem dagar i odling. 
Figur 3. Representativa mikrofotografier från separata givare (A och B) i CTC i odling 5 dagar senare för att isolatividare en cancerpatient blodprov. Cellerna fluorescent färgades för EpCAM med AlexaFluor 488 (grön) och 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för att visualisera kärnan (blå).
Discussion
Det är ofta så att de tidiga stegen i upptäckten av nya cancer läkemedel använda cancer cellinjer, som bär tveksamt likhet med primära cancerceller men fortsätta att användas på grund av sin användarvänlighet i laboratoriet. Forskning om utveckling av nya cancerbehandlingar skulle påskyndas om primära humana cancerceller utnyttjades tidigt i romanen forskningen. CTC är den mest lättillgängliga typen av cancer cell, beroende på deras förekomst i blod och hur lätt en vanlig blodprovstagning. Dessutom cirkulerande tumörceller representerar ett nödvändigt steg i processen för metastas 5,6, så deras relevans för sjukdomen och användbarhet för målinriktning nya läkemedel är tydlig. Isolering av CTC från blod in vitro kompliceras av deras låga koncentrationer: på i storleksordningen en per miljoner leukocyter eller en per miljard erytrocyter 7. De flesta av dagens metoder för att detektera CTC i blod, bland annat den enda FDA-godkända tekniken Cell Sökning (Veridex), skada eller förstöra celler i identifieringsprocessen, utesluter användning utöver uppräkning. Den ovan beskrivna metoden inte äventyrar cellviabiliteten och därmed öppnar dörren för framtida klinisk forskning om cancer. Eller indrivning av intakta celler är målet med denna teknik är det absolut nödvändigt att celler hanteras varsamt, speciellt under stegen blodseparation.
Det finns ett antal inställbara parametrar i detta system som skulle kunna förändras för att uppnå förbättrat utbyte beroende på kritiska egenskaper såsom cancer typ. I de steg som beskrivs ovan, hade vi valt att använda EpCAM som CTC-specifik antikropp för alla cancertyper, utom vid behandling av prostatacancer prover, där anti-PSMA användes. Ytterligare substitutioner av cancer-specifika antikroppar kan säkert användas för att förbättra prestanda för enskilda patienter. Dessutom kan selektin och antikropp koncentrationer ändras för att förbättra capture 8.
"> Ett väsentligt särdrag hos anordningen är införlivandet av E-selektin-molekyler på ytan. E-selektin uttrycks normalt på den luminala ytan av endotelceller och fungerar så att rekrytera snabbrörliga leukocyter till inflammationssäten. Flytande leukocyter binda transient till selektinmolekyler, vilket resulterar i en långsammare, rullande beteende som underlättar långsammare och starkare bindning av cellen till endotelet med integriner. Övertygande experimentella bevis finns som gör så att CTC kan extravasera genom en liknande mekanism 9,10. Införandet av selektin också gör att enheten kan användas vid högre flödeshastigheter, priser som annars skulle hindra celler från att binda till antikroppar 11. Således vår enhet härmar fysiologiskt ett venolen att biomimetically fånga strömmande CTC utan att tillfoga cellulär skada.Förbättrad enhetens prestanda kan hänföras till tillsättning av halloysite nanorör beläggningen till luminalytanav anordningen. Tidigare studier har visat att det finns tre viktiga komponenter i nanoröret beläggning som medger förbättrad funktionalitet. Först ger nanotube beläggningen ökat yta, som medger större protein avlagring på ytan 4. Andra, vid utförande av atomkraftsmikroskopi på nanoröret beläggningen har vi bestämt att individuella nanorör skjuta ut från ytan in i flödet. Detta tillåter selektinmolekyler att presenteras så mycket som en mikron ovanför ytan så att celler kan fångas och rekryteras till ytan tidigare i deras bana genom röret 4. Slutligen är halloysit nanorör beläggningen kan förhindra leukocytadhesion och sprids på ytan, vilket möjliggör ett reducerat antal leukocyter infångade tillsammans med CTC och därför större följande CTC renheter 3.
Disclosures
MRK är en vetenskaplig rådgivare CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Acknowledgments
Det arbete som beskrivs stöddes av Cornell Center på mikromiljön & Metastas via Award nummer U54CA143876 från National Cancer Institute. Innehållet är endast ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Cancer Institute och National Institutes of Health. Detta arbete ytterligare finansierades delvis av en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
