Summary
콜라겐 VII 200 아미노산 (AA 757-967)의 스트레치에 대한 IgG 항체를 정화, 우리의 현재 작업에 설명 된 동물 모델에서 젖어 표현형뿐만 아니라 인간을 특징 조직을과 immunopathological 기능을 재현 마우스에 반복적으로 주입 아르 epidermolysis bullosa acquisita (EBA)
Abstract
자가 면역 현상은 건강한 개인에서 발생하지만, 자기 내성이 실패하면 면역 반응은 특정 병리 될 수 있습니다. 에 따르면 Witebsky의이 면역으로 질병을 진단하는 기준 중 하나를 여긴다는 autoantibodies의 수동 송금을 통해 실험 동물의 질병의 재현입니다. epidermolysis bullosa를 들어 acquisita (EBA), 피부와 점액을 분비하는 세포막의 prototypic 기관이 특정 면역 질환은 여러 실험 모델은 최근에 설립되었다. 콜라겐 VII 200 아미노산 (AA 757-967)의 스트레치에 대한 IgG 항체를 정화, 우리의 현재 작업에 설명 된 동물 모델에서 젖어 표현형뿐만 아니라 인간을 특징 조직을과 immunopathological 기능을 재현 마우스에 반복적으로 주입 아르 EBA 1. 본격적인 확산 질환은 보통 첫 번째 주사 후 5-6일 볼과 질병의 정도는 관리 C의 복용량과 상관 관계있다ollagen VII 특정 IgG. 실험 EBA의 조직 손상 (물집 형성)은 -4 조직에 바인딩 autoantibodies 2에 의해 과립 성 백혈구의 모집 및 활성화에 따라 수 있습니다. 모델이 efferent 면역 반응은 T 세포 독립적 인 위상을 재현 그러므로,이 모델은 면역 조직 손상에 참여 과립에 의존 염증 경로의 해부 할 수 있습니다. 또한, 그 값은 생체에 autoantibodies의 물집을 유발하는 잠재력을 입증하고 EBA 1,3, -6에 물집 형성의 메커니즘을 조사 연구 수에서 빨간 밑줄이 있습니다. 마지막으로,이 모델은 크게 autoantibody 유발 질병의 새로운 항 염증성 요법의 개발을 촉진합니다. 전반적으로, EBA의 수동 전송 동물 모델은 접근과 유익 질병 모델 및 연구자 EBA의 pathogenesis뿐만 아니라 분석하는 것이 아니라 기본적인 생물학적 및 임상 답변을하는 데 도움이됩니다필수 autoimmunity 질문.
Protocol
1. 병원성 항체의 작성
참고 : 항체가 하룻밤 사이에 0.1 M 글리 산도 2.5-3 (용출 버퍼) (ON)에 저장 할 수 없기 때문에 정제 및 항체의 농도가 같은 날에 수행되어야합니다.
IgG의 친 화성 정화 : 면역 토끼 혈청의 25 ML을 사용 :
- 4에 ON 토끼 혈청을 해동 ° C, 20 ° C.에 1xPBS (버퍼를 실행)와 그것에게 1:1 혼합 10 분에 1,260 XG에서 원심 분리기를 선택적 필터 종이 필터링 단계는 혈청은 지방산입니다 경우에 원심 분리 한 후 포함 될 수 있습니다.
- 한편, G 매트릭스는 1XPBS (버퍼를 실행) 10 침대 볼륨 (침대 볼륨 = 매트릭스 볼륨)에 열을 가득 단백질을 씻는다.
- 희석과 컬럼에 혈청 필터링을 적용하고 실온 (RT)에 흔들 플랫폼에서 1 시간을 품다.
- 수집 흐름을 통해 (FT) 50 ML의 Flacon 튜브 인치주세요 을 삭제하지 마십시오 농도까지그리고 정화 IgG의 titer가 알려져있다.
- 1XPBS 5 침대 볼륨과 매트릭스을 씻고 동안 용출 IgG 분획을 수집 50 ML 팔콘 튜브를 준비합니다. 피펫 1 ML의 산도를 중화 버퍼 : 각 관 1 M 트리스 산도 10 일 (그렇지 않으면 수집 할 eluate의 양에 비해 1시 20분 트리스 버퍼의 비율).
- 항목에 0.1 M 글리 산도 2.5-3 50 ML 분율 (들)을 수집 100-150 ML의 용출 버퍼를 적용합니다. , 튜브 2 배를 뒤집기 pH를 측정하고 산도를 7.2-7.4에 도달 할 때까지 중화 버퍼를 추가 할 수 있습니다.
- IgG의 eluate의 몇 방울을 수집하고 etalon 280 나노 미터에서 OD를 측정으로 용출 버퍼를 사용합니다. OD는 <0.1 정지 수집하는 경우.
- 단백질 G 매트릭스를 생성하고는 제조업체의 지침에 따라 저장합니다.
Amicon 튜브와 ultrafiltration의 농도 :
- 15-20 분 centrifuging하여 1XPBS과 Amicon 울트라 (15 ML / 30KDa) ultrafiltration 튜브를 씻어4 ° C.에서 3,220 XG에 Amicon에서 FT 폐기하십시오.
- 25-30 3220 XG의 분, 4 용출 IgG 분획 및 원심 분리기 15 ML과 Amicons을 작성 ° C, 원심 분리 시간은 항상 eluate의 단백질 함량에 따라 달라집니다.
- FT을 취소하고 남은 용출 분획이없는 때까지 ultrafiltration를 반복합니다.
- 원심 분리하여 1XPBS 25-30 분으로, 광범위하게, 두 번 집중 IgG를 씻으십시오.
- 1XPBS의 1,500-2,000 μl의 최종 볼륨의 Amicon 필터에서 '끈적'노란 항체 솔루션을 수집합니다.
- 분광 광도계 또는 NanoDrop를 사용하여 IgG 준비의 측정 농도 :
Conc. (MG / ML) = A (280 nm 정도) × 희석 계수 / 1,4 - 제조업체의 지침에 따라 Amicons을 씻고 저장합니다.
2. 마우스로 콜라겐 VII 특정 IgG의 주입
실제 실험 절차를 시작하기 전에 확인 그 실험 프로tocol이 작성되어 있으며 모든 자료는 실험을 위해 준비가되어 있습니다.
- 질병 득점, ELISAs, immunofluorescence (IF) 분석 및 myeloperoxidase (MPO) 분석 4 데이터 시트를 준비합니다.
- 혈액 및 기관, cryomolds뿐만 아니라 조직학은 처리 및 카세트를 삽입하기위한 튜브를 붙입니다.
- 항체 솔루션은 신선한 준비 또는 주식에서 해동하고 (IF 현미경 및 / 또는 엘리사에 의해 titer)의 반응성에 관한 특징해야합니다. 멸균 필터링 항체 솔루션은 사출에 필요한 용량은 250-1000 μl 사이에 차이가있는 방식으로 PBS에 희석해야합니다. 당신은 전체 실험을 수행하기에 충분한 IgG이 있는지 확인하십시오.
- 준비 신선한 항응고제 : 헤파린 20 U / ML 및 8.7 MG / ML 케타민 / 마취에 대한 1.3 MG / ML xylazine 혼합물.에게 쥐가 준비된 3.7 %의 포름 알데히드와 튜브를 분류했습니다 희생합니다.
- (메스, 가위, 고급 가리킨 curv 수술기구 멸균을에드 forcipes)와 주사기 (인슐린 주사기, 1, 2 ML의 주사기), 바늘, 디지털 카메라와 여분의 메모리 카드를 작성.
참고 : 케타민 / xylazine 또는 isoflurane narcotized 마우스의 모든 절차를 수행 마우스를 신속하게 복구로 Isoflurane은 매일 피부 검사에 대한 선호 마취 옵션입니다.. 그러나, 사진, 87 밀리그램 / kg 케타민과 13 밀리그램 / kg xylazine을 볼 때 일반적으로 피하에 주입합니다. 안락사에 대한 케타민 / xylazine 복용량은 130 밀리그램 / kg 케타민, 20 밀리그램 / kg xylazine로 증가하고 있습니다.
- 자신의 일반적인 건강 상태, 피부와 털 모양의 이미 표시된 동물을 확인을 무게 (항상 같은 귀에 충실)은 귀 두께를 측정합니다.
- 관찰 된 값과 임상 평가 시트의 변경 사항을 등록합니다.
- 항응고제의 동일한 볼륨을 포함하는 주사기의 꼬리 정맥 20-30 μl (2-3 물방울) 피를 수집합니다.
- 모피를 소독하고80 % 에탄올을 사용하여 피부.
- . 피하 인슐린 주사기를 사용하여 뒷면에 항체 솔루션을 주사 (특정 사이트 (예를 들어, 귀) 만 작은 볼륨 (10-50 μl)를 주입 할 가능합니다.)
주사는 매 둘째 날 4 번 반복해야합니다. Balb / C와 약 20 g의 체중 C57BL6 마우스 3-4 낮 750 μg / g 체중 / 사출 autoantibodies에 400-500의 첫 관리 후 질병을 개발하기 시작합니다.
실험을 마무리 할 때 :
- 130 MG / kg와 케타민 / xylazine 피하 20 밀리그램 / kg를 주입하여 깊은 마취법에서 쥐를 넣고, 뒤쪽 대정맥에서 그들을 ...에게서 피를 뽑다하고 심장을 도려내.
- 같은 피부와 같은 기관 / 조직 샘플 수집 : 꼬리, 귀, 피와 식도하고 이전에 표시하고 PBS 또는 3.7 %의 포름 알데히드가 가득 찬 튜브에 넣습니다.
에 반환 할 때연구실 :
- 1200 XG, 별도의 플라즈마에 대한 RT에서 10 분에서 피를 원심 분리기, 적절한 라벨을 튜브로 플라즈마를 전송하고 그에 따라이를 저장합니다.
- 피부가 제대로 cryomolds, 라벨을 사용하여 최적의 컷 온도 매체에 생검, 그리고 -80에서 보관 삽입 ° C.
- 라벨이 삽입 금형에 조직학 목적으로 조직 샘플을 놓고 파라핀 퍼가기까지 3.7 %의 포름 알데히드에 보관.
3. 질병 심각도의 임상 평가
마우스는 피부와 점막의 병변 매일 검토해야하고 결과는 해당 양식을 사용하여 기록해야합니다. 초기 안락사에 대한 기준은 5 병 점수 (표 1)에 대한 의지보다 더 20 몸 표면의 비율 (%)과 세 연속 일 전체 몸무게의 5~10%의 체중 감소에 영향을 미치는 피부 병변입니다.
- 그 배에 마우스를 놓습니다. 오른쪽으로, 즉 머리 지역에서 시작귀 및 물집, erosions, 내부에 지각뿐만 아니라 바깥 쪽면에 있는지 확인합니다. 왼쪽 귀에과 같은 방법을 계속합니다.
- 오른쪽과 왼쪽 눈은 탈모증, 홍반의 신호를 통제 erosions 및 / 또는 지각 있습니다.
- 이마와 코 지역은 코, 입술과 입의 점막의 복부 부분을 계속, 다음을 통해 닦았 있습니다.
- 위쪽으로 이동 앞발로 땅을 차다부터 오른쪽 앞 다리를 검사하고, 왼쪽 앞 다리로 전환합니다. 오른쪽과 왼쪽 뒷다리와 동일한 절차.
- 곡선 훌륭한 포인트 포셉과 목 다시 지역에 모피를 브러시.
- 그 뒷면에 마우스를 켜고 복부 부분뿐만 아니라 사지의 복부 측면 이전에 같은 방법으로 확인합니다.
- 꼬리를 확인합니다.
- 쥐가 질병을 개발 관련 신체 부위의 사진을보세요. 주의는 사진의 품질과 수량에 지불해야합니다.
- 임상 질병 점수를 계산.
4. 피부와 플라즈마 샘플의 분석
- , 저장, 및 / 준비 또는 계획에 따라 모든 수집 된 조직을 처리합니다.
- 에 대한 냉동 조직 섹션을 잘라 IF 토끼 항체와 마우스 보완 시스템 구성 요소의 감지.
- 냉동 조직 및 / 또는 장기 추출물의 다른 단백질과 효소 콘텐츠 (MPO 분석)을 분석합니다.
- 제 파라핀은 조직을 포함 및 조직 손상의 정도를 시각화하기 위해 H & E와 얼룩.
- 엘리사, immunoblot으로 플라즈마를 분석합니다.
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Representative Results
임상 조직 학적 및 immunopathological 수준에서 인간의 EBA 닮은 마우스에서 전체 고장 질병의 항원 특정 항체 결과의 수동 전송됩니다. 수포, 빵 껍질, erosions과 탈모는 귀, 코, 손, 다리, 뒤로 생쥐의 눈 주변에 개발할 수 있습니다. 이 질병의 첫 번째 임상 증상은 대부분의 경우 귀 및 / 또는 머리 영역에 나타납니다. 특정 토끼 IgG 및 마우스 보완 C3의 증착은 IF perilesional 피부 cryosections의 피부 표피 교차로에 직접 감지되어 있습니다. lesional 피부 subepidermal 물집과 염증에 침투는 조직학으로 볼 수 있습니다.
병원성 콜라겐 VII 특정 항체의 주입이 단종되는 경우에는, 질병 활동이 점차 낮은되고, 몇 주 이내에 병변이 치유. 그럼에도 불구하고, postinflammatory cicatricial 탈모증의 특정 정도는 무기한 계속 될 수 있습니다.
Characteriz재조합 autoantigen의 ation (및 병원성 IgG의)
손쥐 콜라겐 특정 IgG는 피부 - 표피 접합 (그림 2B)에 바인딩합니다. 특이성은 immunoblot (그림 2C, 레인 3, 4, 7)에 의해 평가된다.
질병 활동 점수를
질병의 임상 평가는 우리가 개발 한 채점 시스템 (표 1)을 기반으로합니다 :; 1 피부 표면의 1 % 미만, 2, 피부 표면의 1~5%, 0, 노 병변 3, 5 - 10 피부 표면의 %; 4 피부 표면의 10-20%가 영향을받습니다. 손쥐 콜라겐 VII에 대한 IgG는 홍반, 탈모, 물집, erosions, 귀, 눈, 코, 다리와 Balb / C 마우스 (그림 3)의 트렁크에 쌓여과 같은 피부 병변를 유도한다.
조직에 바인딩 및 순환 콜라겐 특정 항체 분석
토끼 IgG 및 마우스 보완 C3의 증착은 detec 아르냉동, perilesional 조직 섹션에서 테드 (그림 4D와 E 각각). subepidermal 물집과 염증이 침투은 조직 학적 샘플 (그림 4 층)에서 볼 수 있습니다. 순환 토끼 항체는 엘리사 (그림 5)에 의해 분석됩니다. 냉동 조직 및 / 또는 장기 추출물들은 단백질과 효소 내용에 대해 서로 다른 assays (MPO 검정)에 의해 분석됩니다.
1 그림. 생체에서의 전체 구조는 콜라겐 VII 특정 항체의 수동 전송에 의해 유도 젖어. 토끼가 손쥐 콜라겐 VII와 토끼 IgG와 함께 예방 접종을 아르는 면역 커에서 정화되어 있습니다. 그 후, 특정 autoantibodies는 사출 / 출혈 일정에 따라 마우스에 피하 주사합니다. 마우스는 일반적인 건강 상태와 매일 질병 증상에 대한 확인되고있다.
그림 2. 병원성 콜라겐 VII 특정 IgG의 특성화. 간접 IF 미리 면역 토끼 혈청과 손쥐 콜라겐 VII 특정 면역 토끼 혈청없이 증착의 결과 (A)과의 autoantibodies의 증착과 incubated 소금 분할 일반 마우스 피부 섹션의 분석 피부 표피 접합 (B), 각각. 특정 항체들이 (C, 레인 3, 4, 7) 재조합 손쥐 콜라겐 VII 조각을 중복의 집합으로 immunoblot을 수행 할 때에 대해 제기 된 항원 (들)을 인식하고 있습니다.
그림 3. 마우스의 임상 평가. IgG 손쥐 콜라겐 VII에는 탈모, 물집, erosions, 귀에서 빵 껍질, 눈, 코, 리 등의 피부 병변을 유도MBS 및 Balb / C 마우스 (AD)의 트렁크. 무관심 단백질에 대한 NRIgG 나 애비와 함께 주입 사람은 0 (E)의 점수를 가지고 반면, 특정 autoantibodies로 주입 마우스는 4 점수에 도달합니다. 임상 점수는 다음과 같이 계산 : 0, 안 병변, 1, 피부 표면 1 % 미만, 2, 피부 표면의 1-5%, 3, 피부 표면의 5~10%, 4, 10 - 피부 표면의 20 %가 영향을받습니다. 최종 점수에 추가 점 3 개 연속 일 카운트 동안 총 몸무게의 5-10%의 무게 손실.
4 그림. 토끼 IgG (D), 및 마우스 보완 C3 (E)의 콜라겐 VII 특정 IgG. 증착을 주입 쥐 조직을하고 immunopathological 연구 결과는 perilesional 피부 cryosections의 피부 표피 접합의 IF, 생체에서 직접 감지합니다. lesional 피부 subepidermal 물집과 염증 INF에서iltrate는 조직학 (F)에 의해 볼 수있다. 토끼 IgG (A), 마우스 보완 C3 (B),이나의 어떠한 증착은 컨트롤 (C)에서 볼 수 subepidermal 물집이 형성되지 않습니다.
그림 5. 토끼 항체를 순환의 콜라겐 VII 특정 IgG와 함께 주입 마우스에서 플라즈마의 면역. 플라즈마 수준은 엘리사에 의해 측정되었다.
표 1. 질병 점수 시트를 젖어 피부. 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
시스템을 채점 :
- 0, 노 병변,
- 1, 피부 표면의 1 % 미만,
- 2, 피부 표면의 1-5%,
- 피부 스와의 3 5~10%rface;
- 4, 피부 표면의 10~20%가 영향을받습니다.
추가 힌트 골 :
- 최종 점수 17 엑스트라 포인트를 3 개 연속 일 카운트 동안 총 몸무게의 5-10%의 무게 손실.
- 그들은 단지 관찰 촬영 정량화되지 않은 물집이나 탈모와 짝을하지 않을 경우 손에있는 눈 주위의 귀가에 홍반, 제발, 지속적인 면역 반응의 첫 번째 징후입니다.
- 꼬리에 마크가 반드시 질병으로 인해하지 않을 수 있습니다 그들의 악화 처음부터 존재하면, 입이나 전투 표시 될 수 있습니다. 을 계산에 날씨 신중하게!
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Discussion
실험 동물에 autoantibodies의 수동 전송은 pathogenicity 7, -12를 입증 할 주요 접근 방법입니다. 이 방법을 통해 얻은 동물 모델은 autoimmunity 13 간접적 인 증거 할뿐만 아니라, 병원성 메커니즘의 efferent 단계의 조사를 할 수 있습니다. epidermolysis bullosa acquisita (EBA)으로 젖어 항체 유발 과립에 의존 피부의 수동 전송 모델은 면역 dermatoses에서 조직 손상의 메커니즘을 해부하는 데 사용되었다. 그것은 잘 콜라겐 VII에 대한 autoimmunity의 한계 넘어 확장 항체로 인한 장기 별 면역 질환의 기본, 생물학적 및 임상 중요한 측면을 연구 할 수있는 정교하게 될지는 모델 병으로도 나타났다. 마지막으로,이 모델은 지하 막 생물학 등의 기초 생물학 및 pathophysiological 프로세스,, 면역 단지의 과립 활성화를 공부하는 데 사용할 수 있습니다d 개의 보완 활성화.
예 생체과 동물 모델을 포함한 여러 실험 설정,자가 면역 피부 질환 EBA 14을 사용할 수 있지만, 훨씬 과립에 의존 염증 경로를 연구하기에 가장 적합한 동물에 autoantibodies의 수동 전송합니다. 과립 성 백혈구는 이전에 autoantibodies 15 incubated 피부 섹션에 추가됩니다 예 생체 모델에 대조적으로, 여기에 백혈구의 침윤이 자발적으로 마우스에 의해 재현되어 있습니다. 우리가 이러한 토끼와 염소와 같은 다른 생물체에서 항원에 대해 제기 특정 항체 함께 작동하도록 선택하는 경우 또한, 우리는 제한된 환자 커 가용성의 문제점을 방지하고 또한 보완 활성화 및 과립 모집 16 재현 할 수있는 좋은 기회가 있습니다.
수동 전송 모드에서 과립에 의존 젖어의 성공적인 번식을위한EBA의 말은, 그 물집, 빵 껍질 및 탈모증과 erosions을 통해 홍반과 부종으로 시작, 충분히 질병의 징후를 채점 할 수 있도록 중요합니다. 마우스의 평가는 이전에 학습해야 할 과정입니다. 질병의 점수는 공동 작업자 또는 원조 사람이 실험을하는 동안, 동일한 사람에 의해 수행하고 항상 배치해야합니다. 각 실험 질병에 대한 표준화 점수 시스템의 개발 및 사용 outmost 중요하다. 동봉 된 점수 시트 독자에게 피부 dermatoses는 마우스에서 평가하는 방법에 대한 통찰력을 제공한다.
로 동영상에 나타난 수행 할 때 autoantibody 유발 subepidermal 젖어의 모델은 크게 autoantibodies 및 조직 손상의 결과에 의해 트리거 과립에 의존 염증 경로의 추가 절개를 용이하게합니다. 의료 연구의 가치는 새로운 항원을 개발하고 테스트 유망 관점에서 지원pecific T와 B 세포는 항 염증 치료를 타겟팅. 마지막으로, 그것은 근본적인 생물학적 및 임상 필수 autoimmunity 질문에 답변에 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 프라이 부르크 (Freiburg) 대학 (CS까지)의 의료 학부에서 독일 Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1과 BIOSS에서 교부금의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
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