Granulocytt-avhengige autoantistoffer-indusert Skin Blemmer

Summary

I dyremodellen beskrevet i vår foreliggende arbeid, renset IgG-antistoffer mot en strekning av 200 aminosyrer (aa 757-967) av kollagen VII er injisert gjentatte ganger i mus reproduserende blistering fenotypen samt histo-og immunopathological funksjoner karakteristiske til menneske Epidermolysis bullosa acquisita (EBA)

Abstract

Autoimmune fenomener oppstår hos friske individer, men når selv toleranse mislykkes, kan autoimmun reaksjon resultere i spesifikk patologi. Ifølge Witebsky største postulater, ett av kriteriene i å diagnostisere en sykdom som autoimmun er gjengivelse av sykdommen i forsøksdyr ved passiv overføring av autoantistoffer. For Epidermolysis bullosa acquisita (EBA), en prototypic organspesifikk autoimmun sykdom av hud og slimhinner, ble flere eksperimentelle modeller nylig etablert. I dyremodellen beskrevet i vår foreliggende arbeid, renset IgG-antistoffer mot en strekning av 200 aminosyrer (aa 757-967) av kollagen VII er injisert gjentatte ganger i mus reproduserende blistering fenotypen samt histo-og immunopathological funksjoner karakteristiske til menneske EBA ^1. Fullverdig utbredt sykdom ses vanligvis 5-6 dager etter den første injeksjonen og omfanget av sykdommen korrelerer med dosen av den administrerte collagen VII-spesifikk IgG. Vevsskaden (blæredannelse) i den eksperimentelle EBA avhengig rekruttering og aktivering av granulocytter ved vev-bundet autoantistoffer ^{2, -4.} Derfor gir denne modell for disseksjon av granulocytt-avhengige inflammatoriske pathway involvert i autoimmune vevsskade, som modell reproduserer bare T-celle-uavhengig fase av efferent autoimmun respons. Videre er dens verdi understreket av en rekke studier som viser blemmeaktig induserende potensialet av autoantistoffer in vivo og undersøke mekanismen av blæredannelse i ^{1,3 EBA, -6.} Til slutt vil denne modellen i stor grad forenkle utviklingen av nye anti-inflammatorisk behandling i autoantistoff-induserte sykdommer. Totalt sett er passiv overføring dyremodell av EBA et tilgjengelig og lærerikt sykdom modell og vil hjelpe forskerne å analysere ikke bare EBA patogenese, men å svare grunnleggende biologisk og kliniskessensielle autoimmunitet spørsmål.

Protocol

1. Forberedelse av patogene antistoff

Merknad: Rensing og konsentrasjon av antistoffer utføres på samme dag, som antistoffer er ikke å bli lagret i 0,1 M glycin pH 2,5 til 3 (elueringsbuffer) over natten (ON).

Affinitetsrensing av IgG: bruke 25 ml immun kaninserum:

1. Tine kaninserum PÅ ved 4 ° C, bland det 1:1 med 1xPBS (rennende buffer) og sentrifuger den på 1260 xg i 10 min ved 20 ° C. Eventuelt kan en filtrering trinn med filterpapir inngå etter sentrifugering i tilfelle serum er fettstoffer.
2. Mellomtiden vaske proteinet G matrisen fylt kolonne med 10 seng volumer (bedvolum = matrise volum) av 1XPBS (rennende buffer).
3. Påfør utvannet og filtrert serum til kolonnen og inkuber 1 time på rocking plattformen ved romtemperatur (RT).
4. Samle gjennomstrømningskanalen (FT) i en 50 ml flacon rør. Ikke kast det før konsentrasjonenog titer av det rensede IgG er kjent.
5. Vask av matrisen med 5 seng mengder 1XPBS og i mellomtiden forberede 50 ml Falcon-rør for oppsamling av den eluerte IgG fraksjonen. Pipetter en ml pH nøytraliserende buffer: 1 M Tris pH 10 i hvert rør (ellers andelen 1:20 TRIS-buffer i forhold til mengden av eluatet samles).
6. Påfør 100-150 ml elueringsbuffer: 0,1 M glycin pH 2,5 til 3 til kolonnen og samle 50 ml fraksjon (er). Vend røret 2-3x, måle pH og legge nøytraliserende buffer før du har nådd pH 7.2 til 7.4.
7. Samle noen dråper IgG eluat og bruke elueringsbuffer som Etalon måle OD ved 280 nm. Hvis OD er ​​<0,1 slutte å samle.
8. Regenerere protein G matrise og lagre det i henhold til produsentens instruksjoner.

Konsentrasjon ved ultrafiltrering med Amicon rør:

1. Vask Amicon Ultra (15 ml / 30KDa) Ultrafiltrering rør med 1XPBS ved sentrifugering 15-20 minpå 3220 xg ved 4 ° C. Kast FT fra Amicon.
2. Fyll Amicons med 15 ml eluerte IgG fraksjonen og sentrifuger i 25-30 min ved 3220 xg og 4 ° C; sentrifugering tid alltid avhenger proteininnholdet eluatet.
3. Kast FT og gjenta ultrafiltrasjon til du har ingen eluerte brøkdel igjen.
4. Vask den konsentrerte IgG omfattende, to ganger, med 1XPBS 25-30 min ved sentrifugering.
5. Samle "klebrig", gulaktig antistoff løsning fra Amicon filter i et endelig volum på 1,500-2,000 ul 1XPBS.
6. Mål konsentrasjonen av IgG forberedelse ved hjelp av et spektrofotometer eller NanoDrop:
   Kons. (Mg / ml) = A (280 nm) x fortynningsfaktor / 1,4
7. Vask og lagre Amicons etter produsentens instruksjoner.

2. Injeksjon av kollagen VII-spesifikk IgG inn Mus

Før du starter selve eksperimentelle prosedyren, sørg for at den eksperimentelle proprotokollen er skrevet og alle materialer er forberedt på forsøket.

1. Forbered datablader for sykdommen scoring, ELISAs, immunfluorescens (IF) analyse og myeloperoksidase (MPO) assay ^4.
2. Merke rørene for blod og organer, cryomolds samt histologi behandling og innebygging kassetter.
3. Antistoff løsninger bør være forberedt fersk eller tint fra aksjer og karakterisert med hensyn til reaktivitet sitt (titer av IF mikroskopi og / eller ELISA). Den sterilfiltrert antistoff oppløsningen skal fortynnes i PBS på en måte som den nødvendige dosen for injeksjon varierer mellom 250-1000 pl. Sørg for at du har nok IgG til å utføre hele forsøket.
4. Tilberede ferske antikoagulant: heparin 20 U / ml og 8,7 mg / ml ketamin / 1,3 mg / ml xylazin blanding for anestesi. Når ofre musene har merket rør med 3,7% formaldehyd forberedt.
5. Sterilisere kirurgiske instrumenter (skalpell, saks, fine poeng og curved forcipes) og forberede sprøyter (insulin sprøyter, 1 og 2 ml sprøyter), nåler, digitalkamera og ekstra minnekort.

Merk: Utfør alle prosedyrer på ketamin / xylazin eller isofluran narcotized mus isofluran er den foretrukne anestesi alternativet for de daglige hud sjekker, som mus komme seg raskt.. Imidlertid er ved fotografering, 87 mg / kg ketamin og 13 mg / kg xylazin vanligvis injisert subkutant. For eutanasi på ketamin / xylazin dosen økes til 130 mg / kg ketamin og 20 mg / kg xylazin.

1. Sjekk de allerede merket dyr for deres generelle helsetilstand, hud og pels utseende, veie dem og måle deres øre tykkelse (alltid holde oss til samme øret).
2. Registrer observerte verdiene og endringer i klinisk evaluering ark.
3. Samle 20-30 pl (2-3 dråper) blod fra halevenen i en sprøyte som inneholder det samme volumet av antikoagulant.
4. Desinfisere pels oghuden ved hjelp av 80% etanol.
5. Injiser antistoff løsning subkutant i ryggen med en insulinsprøyte. (For enkelte områder (f.eks ørene) bare små mengder (10-50 ul) er mulig å injiseres.)

Injeksjonene bør gjentas hver annen dag, 4 ganger. Balb / c og C57BL6 mus av en kroppsvekt på ca 20 g begynner å utvikle sykdommen 3-4 dager etter den første administrering av 400-500 opptil 750 ug / g kroppsvekt / injeksjon autoantistoffer.

Når etterbehandling eksperimentet:

1. Sett musene under dyp narkose ved å injisere 130 mg / kg og 20 mg / kg ketamin / xylazin subkutant, exsanguinate dem fra bakre vena cava og kutte hjertet ut.
2. Samle organer / vevsprøver som hud: hale, øre, blod og spiserør og sette dem i tidligere merket og PBS eller 3,7% formaldehyd fylt rør.

Når du returnerer tillaboratorium:

1. Sentrifuger blod på 1200 xg, 10 min ved RT å skille plasma, overføre plasma til korrekt merket rør og lagre dem deretter.
2. Bygg inn hudbiopsi i Optimal Cut Temperatur medium med cryomolds, merkes skikkelig, og lagre dem på -80 ° C.
3. Plasser vevsprøver ment for histologi i de merkede innebygging molds og holde dem i 3,7% formaldehyd til parafin innebygging.

3. Klinisk Evaluering av sykdommens alvorlighetsgrad

Mus bør undersøkes daglig for lesjoner i hud og slimhinner og funnene bør registreres ved hjelp av egnede former. Kriteriene for tidlig eutanasi er hudlesjoner påvirker mer enn 20% av kroppsoverflaten og et vekttap på 5-10% av den totale kroppsvekt i tre påfølgende dager, telt for en sykdom vurdering av 5 (Tabell 1).

1. Plasser musen på buken. Start med hodet området, nemlig med den retteøret og se etter blemmer, erosjoner, crust på den indre så vel som på yttersiden. Fortsett på samme måte med venstre øre.
2. Høyre og venstre øye er kontrollert for tegn på erytem, ​​alopecia, erosjonsskader og / eller skorpe.
3. Pannen og snute området er børstet gjennom neste, fortsetter med den ventrale delen av snuten, leppe og slimhinnen i munnen.
4. Undersøke høyre beinet starter fra labben, beveger seg oppover, bytte til venstre forbeinet. Samme prosedyre med høyre og venstre bakbein.
5. Børst gjennom pelsen på nakke og rygg med en buet fin spiss tang.
6. Snu musen på ryggen og sjekk ventrale delen samt ventrale sidene av lemmer på samme måte som tidligere.
7. Sjekk halen.
8. Ta bilder av relevante kroppsdeler der musene utvikler sykdom. Oppmerksomheten må rettes mot kvalitet og kvantitet av bildene.
9. Beregn klinisk sykdom score.

4. Analyse av huden og plasma

1. Forbered, lagre og / eller behandle alle innsamlede vev i henhold til planen.
2. Skjær frosne vevsdelene for IF påvisning av kanin antistoffer og mus komplement systemkomponenter.
3. Analysere forskjellig protein og enzyminnhold (MPO assay) av frosne vev og / eller organ-ekstrakter.
4. § parafinen innebygde vev og flekken med H & E å visualisere omfanget av vevsskade.
5. Analyser plasma ved ELISA, immunoblot.

Representative Results

Den passive overføring av antigen spesifikke antistoffer resulterer i en full blåst sykdommen hos mus, ligner på kliniske, histologiske og immunopathological nivåer menneskets EBA. Blemmer, skorper, erosjoner og alopecia utvikle seg på ørene, snute, poter, bena, ryggen og rundt øynene til musene. De første kliniske tegn på sykdommen vil sannsynligvis dukke opp på ørene og / eller hodet området. Nedfall av spesifikke kanin IgG og mus komplement C3 oppdages ved direkte IF på dermal epidermal krysset i cryosections av perilesional hud. I lesional hud subepidermal blemmer og inflammatoriske infiltrere blir sett av histologi.

Men dersom injeksjon av patogene kollagen VII-spesifikke antistoffer er avviklet, blir sykdommen aktiviteten gradvis lavere, og i løpet av flere uker lesjoner leges. Likevel kan en viss grad av postinflammatorisk dels forminsker alopecia vedvare ubestemt tid.

Characterizasjon av det rekombinante autoantigen (og av patogene IgG)

Murine kollagen spesifikk IgG bindes på dermal-epidermale krysset (figur 2B). Spesifisiteten vurderes ved immunoblotanalyse (Fig. 2C, søyle 3, 4 og 7).

Scoring sykdomsaktivitet

Den kliniske evaluering av sykdom er basert på et poengsystem vi utviklet (Tabell 1): 0, ingen lesjoner; 1, mindre enn 1% av hudoverflaten, 2, 1-5% av hudoverflaten, 3, 5 - 10% av hudoverflaten, 4, 10-20% av hudoverflaten påvirkes. IgG mot muse kollagen VII induserer kutane lesjoner som erytem, ​​alopeci, blemmer, erosjoner, skorper på ørene, øyne, snute, lemmer og bagasjerommet på Balb / c mus (figur 3).

Analyse av vev-bundet og sirkulerende kollagen-spesifikke antistoffer

Nedfall av kanin IgG og mus komplement C3 er deteksjonted i frosne, perilesional vevsdelene (Figur 4D og E henholdsvis). De subepidermal blemmer og den inflammatoriske infiltrere er sett i histologiske prøver (Figur 4F). Sirkulerende rabbit antistoffer analysert ved ELISA (Figur 5). Frosne vev og / eller organ-ekstrakter analysert ved forskjellige analyser for deres protein og enzym innhold (MPO analysen).

Figur 1. Generell ordningen av in vivo blistering indusert ved passiv overføring av kollagen VII-spesifikke antistoffer. Kaniner blir immunisert med murint kollagen VII og kanin IgG renses fra immun sera. Deretter blir de spesifikke autoantistoffene injisert subkutant i mus etter en injeksjon / blødning tidsplan. Mus blir kontrollert for generell helsetilstand og sykdom skiltene daglig.

Figur 2. Karakterisering av patogene kollagen VII-spesifikk IgG. Indirekte IF analyse av salt-splitt normal mus hud seksjoner inkubert med pre-immun-kaninserum og med murine kollagen VII-spesifikke immun kaninserum resultater på deponering (A) og avsetning av autoantistoffer ved dermal epidermal junction (B), henholdsvis. De spesifikke antistoffer gjenkjenne antigen (er) de ble reist mot når immunoblotanalyse med et sett av overlappende rekombinante murine kollagen VII fragmenter utføres (C, søyle 3, 4 og 7).

Figur 3. Klinisk evaluering av mus. IgG til murine kollagen VII induserer kutane lesjoner som alopecia, blemmer, erosjoner, skorper på ørene, øynene, snute, liMBS og bagasjerommet på Balb / c mus (AD). Mus injisert med spesifikke autoantistoffer nå en score på 4, mens de som injisert med NRIgG eller ABS mot en likegyldig protein hadde en score på 0 (E). Den kliniske vurdering ble beregnet som følger: 0, ingen lesjoner; 1, mindre enn 1% av hudoverflaten, 2, 1-5% av hudoverflaten, 3, 5-10% av hudoverflaten, 4, 10 - 20% av hudoverflaten påvirkes. Vekttap på 5-10% av den totale kroppsvekten under tre påfølgende dager teller som et ekstra punkt i sluttresultatet.

Figur 4. Histo-og immunopathological funn hos mus injisert med kollagen VII-spesifikk IgG. Deposition av kanin IgG (D), og mus komplement C3 (E) er detektert ved direkte hvis på dermal epidermal krysset i cryosections av perilesional hud, in vivo. I lesional hud subepidermal blemmer og inflammatorisk infiltrate er sett av histologi (F). Ingen avsetning av kanin IgG (A), mus komplementet C3 (B), og heller ikke er subepidermal blæredannelse sett i kontrollene (C).

Figur 5. Immunoanalyse plasma fra mus injisert med kollagen VII-spesifikk IgG. Plasmanivåer av sirkulerende kanin antistoffer ble målt med ELISA.

Tabell 1. Skin blemmer sykdom scoring ark. Klikk her for å se større tabell .

Scoring system:

• 0, ingen lesjoner;
• 1, mindre enn 1% av hudoverflaten;
• 2, 1-5% av hudoverflaten;
• 3, 5-10% av huden surface;
• 4, er 10 til 20% av hudoverflaten berørt.

Ekstra hint når scoring:

• Vekttap på 5-10% av den totale kroppsvekten under tre påfølgende dager teller som et ekstra punkt i sluttresultatet 17.
• Erytem på ørene, rundt øynene på potene er bare de første tegn på en pågående immunreaksjon, hvis ikke er sammenkoblet med blemmer eller alopecia de ikke tallfestet, bare tatt under observasjon.
• Merker på halen kan være bite eller kjempe merker, så hvis de er til stede fra starten sin forverring kanskje ikke nødvendigvis være på grunn av sykdommen. Vurder nøye vær å telle dem!

Discussion

Den passive overføring av autoantistoffer i forsøksdyr er en stor tilnærming for å demonstrere deres patogenitet ^{7, -12.} Dyremodeller oppnådd gjennom denne fremgangsmåten, i tillegg til å være den indirekte bevis for autoimmunitet ^13, tillate undersøkelse av efferente fasen av patogene mekanismen. Den passive overføringen modell av antistoff-indusert granulocytt-avhengige hud blemmer på Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) ble brukt til å dissekere mekanismene for vevsskader i autoimmune dermatoses. Det dukket også, som en utsøkt lærerik modell sykdom å studere grunnleggende, biologisk og klinisk viktige aspekter av antistoff-mediert organ-spesifikke autoimmune sykdommer som strekker seg langt utover grensene for autoimmunitet mot kollagen VII. Endelig kan denne modellen benyttes til å studere fundamentale biologiske og patofysiologiske prosesser, herunder basalmembran biologi, granulocytt aktivering av immunkomplekser end komplementaktivering.

Selv om flere eksperimentelle innstillinger, inkludert ex vivo og dyremodeller, er tilgjengelig for autoimmune hudsykdommen EBA ^14, den klart mest egnet til å studere granulocytt-avhengige inflammatoriske trasé er passiv overføring av autoantistoffer til dyr. I motsetning til den ex vivo modellen, hvor granulocyttene tilsatt til huden seksjoner tidligere inkubert med autoantistoffer ^15, her infiltrasjon av leukocytter er spontant reprodusert av musene. Videre, hvis vi velger å arbeide med spesifikke antistoffer reist mot antigen i andre organismer, som for eksempel kanin og geit, unngår vi problemet med begrenset pasientsera tilgjengelighet og vi har også en bedre sjanse til å reprodusere komplementaktivering og granulocytt rekruttering ^16.

For den vellykkede gjengivelse av granulocytt-avhengige blemmer i passiv overføringsmodusl av EBA, er det viktig å være i stand til å tilstrekkelig scorer tegn på sykdom, som starter med erytem og ødem gjennom blemmer, erosjoner med skorper og alopecia. Evalueringen av mus er en prosess som må tidligere lært. Scoring av sykdommen må utføres av samme person, gjennom hele forsøket og alltid avgitt av en samarbeidspartner eller hjelpemiddel person. Utvikling og bruk av en standardisert scoring system for hver eksperimentell sykdom er av den ytterste viktighet. Den vedlagte scoring arket skal gi leseren et innblikk hvordan huden dermatoses er evaluert i mus.

Når utført som vist i videoen, vil modellen av autoantistoff-indusert subepidermal blemmedannelse stor grad forenkle ytterligere disseksjon av granulocytt-avhengige inflammatoriske trasé utløst av autoantistoffer og resulterende i vevsskade. Sin verdi i medisinsk forskning er støttet av den lovende perspektiv for å utvikle og teste ny antigen-specific T og B-celle målrettet anti-inflammatorisk behandling. Til slutt vil det hjelpe i å svare grunnleggende biologisk og klinisk viktige autoimmunitet spørsmål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
recombinant antigen			The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author.
immune rabbit serum	www.eurogentec.com		We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium.
Protein G agarose	Roche Applied Science	11243233001
Balb/c mice	Charles River Laboratories
OCT compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek	4583	OCT, optimal cutting temperature
Cryomold standard	Sakura Finetek	4557	25 mm × 20 mm × 5 mm
Cryomold intermediate	Sakura Finetek	4566	15 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link-Einbettkassette	R. Langenbrinck	09-0503	Histology processing and embedding cassettes
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz	H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG	71492000	tattooing paste
Tatowierzange TZ1	EBECO E. Becker Co GmbH		tattooing device
Heparin	Carl Roth GmbH Co.	7692.1
Formaldehyde 37%	Carl Roth GmbH Co.	7386
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	K2753-1G
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	X1251-1G
sterile PBS	Biochrom	L182-50
digital camera	Nikon	Coolpix 5400
Syringe driven filter unit 0.45 μm	Millipore
Caliper	Mitutoyo 7309	1667338	Farnell (distributor)
disease scoring sheet			example enclosed