Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.
Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 – e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1.
A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10.
Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 – e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.
Manutenção da integridade do genoma é essencial para a sobrevivência da célula. A falta de preservar os resultados do genoma em envelhecimento prematuro, carcinogênese, a morte ou 8. Há um grande interesse em discernir como as funções de DDR, decorrentes da sua importância para a pesquisa básica e clínica. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para ajudar no estudo de como as células detectar e reparar danos no DNA. Métodos tradicionais, como imunocitoquímica e western blot…
The authors have nothing to disclose.
Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU – Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).
Product | Company |
CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
MEM media | GIBCO |
Non-essential amino acids | GIBCO |
Amino acids | GIBCO |
Vitamins | GIBCO |
Sodium Pyruvate | Invitrogen |
Penicillin/Streptomycin | HyClone |
Fetal Bovine Serum | GIBCO |
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
SuperFect | Qiagen |
Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |