DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング
Summary
このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。
Abstract
二本鎖切断（DSB）は、最も有害なDNAが細胞に発生する可能性病変である。未修復のままにしておくと、DSBは港の大きな可能性は、突然変異と染色体異常を生成するには1。 DSBを検出する細胞は、DNA損傷応答（DDR）を活性化し、DNAを修復するためにゲノム不安定性を触媒から外傷を防止するために、それは非常に重要です。刺激された時、DDRは修理が行われるか、細胞がアポトーシスを受けるように強制することを可能にするために、細胞周期の停止を誘発することによりゲノムの完全性を維持するために動作します。 DSB修復の主なメカニズムは、非相同末端結合（NHEJ）と相同組換え修復（HRR）（2件）を介して行われます。その活動が適切に機能するためにDDRのために正確に画策しなければならない多くのタンパク質があります。ここで、我々は2のための方法を記述する – そしてこれらのタンパク質の1の3次元（D）の可視化、53BP1。
p53結合タンパク質1（53BP1）は、の領域に局在する5-15分5内の病巣を形成し、修正されたヒストン3,4に結合することによりDSBは。 DSB部位に53BP1と他のDDRタンパク質のヒストン修飾とリクルートは、損傷の領域の周りクロマチンの構造的再編成を促進し、DNA修復6に寄与すると考えられている。修理の直接参加以外にも、追加の役割は、このようなイントラSチェックポイント、G2 / Mチェックポイント、および活性化下流のDDRタンパク質7-9規制として、DDRで53BP1のために記載されている。最近では、53BP1代わりにDSBが6の近傍に局在する前にG1を入力するセルを待って、有糸分裂時に誘発されるDNA損傷に応答して病巣を形成していないことが発見されました。そのような53BP1などのDDRタンパク質は細胞分裂から10までの進行の間に分裂構造（原体など）に関連付けることが見出されている。
視覚化すると3-Dライブセルイメージング – このプロトコルでは、我々は2の使用を記述するDNA損傷剤カンプトテシン（CPT）と同様に、有糸分裂時の53BP1の行動に応じて53BP1フォーカスの形成。カンプトテシンは主としてDNA複製の間にDSBを引き起こすトポイソメラーゼI阻害剤である。これを達成するために、我々は前述の53BP1-mCherry蛍光融合タンパク質はDSBは11に結合することができる53BP1タンパク質ドメインからなる構築に使用。また、ヒストンH2B-GFP蛍光融合タンパク質が有糸分裂中に12細胞周期全体が、特にクロマチンダイナミクスを監視することができる構築するために使用。複数のディメンションでライブセルイメージングは、真核細胞におけるDDRタンパク質の機能の理解を深めるための優れたツールです。
Protocol
Discussion
ゲノムの完全性の維持は、細胞の生存にとって極めて重要である。早期老化、発癌、または死亡の8ゲノムの結果を保持するために失敗しました。目利きに強い関心がありますどのように基礎および臨床研究の両方に重要な役割を果たすから生じるDDR機能、。多くの技術は、細胞がDNA損傷を検出し、修復方法の研究を支援するために長年にわたって開発されてきた。最近の技術の進歩?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01NS064593とR21ES016636（KV）によって部分的にサポートされています。顕微鏡はVCUで行われました – 神経生物学、解剖学顕微鏡ファシリティ省、NIH NINDSセンターコアグラント5P30NS047463の資金援助で、部分的には、サポートされています。回転するディスク共焦点顕微鏡は、NIH-NCRR賞（1S10RR027957）で購入されました。
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
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