Duas e três dimensões imagens de células vivas de Proteínas de DNA resposta a danos
Summary
Este protocolo descreve um método para a visualização de um DNA double-strand proteína quebra de sinalização activada em resposta a danos no ADN, bem como sua localização durante a mitose.
Abstract
Duplo-strand breaks (LAP) são o DNA mais deletéria lesões uma célula pode encontrar. Se deixado sem reparos, DSBs potencial grande porto para gerar mutações e aberrações cromossômicas 1. Para evitar este trauma de catalisar a instabilidade genômica, é crucial para que as células detectam DSBs, ativar a resposta de danos no DNA (DDR), e reparar o DNA. Quando estimulado, o DDR trabalha para preservar a integridade genómica, desencadeando paragem do ciclo celular para permitir a reparação para ter lugar ou forçar a célula a apoptose. Os mecanismos predominantes de reparação de DSB de ocorrer através da extremidade não homóloga-joining (NHEJ) e homóloga recombinação reparação (HRR) (revista em 2). Há muitas proteínas cujas atividades devem ser precisamente orquestrada para a DDR para funcionar corretamente. Relata-se um método para a 2 – e 3-dimensional de visualização (D) de uma destas proteínas, 53BP1.
A proteína p53 de ligação 1 (53BP1) localiza a áreas deDSBs ligando-se a histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. As modificações de histonas e recrutamento de proteínas e de outros 53BP1 DDR para locais DSB são acreditados para facilitar o rearranjo estrutural da cromatina em torno das áreas de danos e de contribuir para a reparação do ADN 6. Além da participação direta na reparação, funções adicionais têm sido descritos para 53BP1 no DDR, como regular um posto de controle intra-S, um checkpoint G2 / M, e ativar proteínas jusante DDR 7-9. Recentemente, descobriu-se que não se forma 53BP1 focos em resposta ao dano do DNA induzido durante a mitose, em vez de espera para as células antes de introduzir a localização de G1 para a vizinhança de DSBs 6. Proteínas, tais como DDR 53BP1 foram encontrados para associar com estruturas de mitose (por exemplo, cinetocoros), durante a progressão através da mitose 10.
Neste protocolo, descrevemos o uso de 2 – e 3-D imagens de células vivas para visualizara formação de focos 53BP1, em resposta ao agente danificador de ADN camptotecina (CPT), bem como o comportamento 53BP1 durante a mitose. A camptotecina é um inibidor da topoisomerase I, que provoca principalmente DSBs durante a replicação do ADN. Para conseguir isto, foi utilizado um anteriormente descrito 53BP1-mCherry proteína de fusão que consiste em fluorescente construir um domínio de proteína capaz de se ligar 53BP1 DSBs 11. Além disso, utilizou-se uma histona H2B-GFP fluorescente construir a proteína de fusão capaz de controlar a dinâmica da cromatina ao longo do ciclo celular, mas em particular durante a mitose 12. Imagens de células vivas em múltiplas dimensões é uma excelente ferramenta para aprofundar nossa compreensão da função de proteínas DDR em células eucarióticas.
Protocol
Discussion
Manutenção da integridade do genoma é essencial para a sobrevivência da célula. A falta de preservar os resultados do genoma em envelhecimento prematuro, carcinogênese, a morte ou 8. Há um grande interesse em discernir como as funções de DDR, decorrentes da sua importância para a pesquisa básica e clínica. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas ao longo dos anos para ajudar no estudo de como as células detectar e reparar danos no DNA. Métodos tradicionais, como imunocitoquímica e western blot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Suportado em parte pela R01NS064593 e R21ES016636 (KV). Microscopia foi realizada no VCU – Departamento de Neurobiologia e Anatomia Facilidade Microscopia, suportado, em parte, com recursos do NIH-NINDS Centro núcleo concessão 5P30NS047463. O microscópio confocal disco giratório foi comprado com um prêmio NIH-NCRR (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
