عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.
Abstract
انقر نقرا مزدوجا حبلا فواصل (DSBs) هي الأكثر ضررا آفات الحمض النووي خلية يمكن أن تواجهها. إذا تركت دون اصلاح، DSBs الميناء إمكانيات كبيرة لتوليد الطفرات والتشوهات الكروموسومية 1. لمنع هذه الصدمة من عدم الاستقرار الجيني تحفيز، لا بد للخلايا للكشف عن DSBs، تنشيط استجابة الحمض النووي من التلف (DDR)، وإصلاح الحمض النووي. عندما حفز، وDDR تعمل على الحفاظ على سلامة الجينوم عن طريق إحداث خلية للسماح اعتقال دورة للإصلاح أن يتم إجبار الخلية أو الخضوع لموت الخلايا المبرمج. الآليات السائدة لإصلاح جهاز تسوية المنازعات من خلال الانضمام تحدث في نهاية امتماثلان (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي إصلاح (HRR) (مشاركة في 2). هناك العديد من البروتينات التي يجب أن أنشطة مدبرة بدقة لDDR بشكل صحيح. هنا، نحن تصف طريقة ل2 – و 3 الأبعاد (D) من التصور واحدة من هذه البروتينات، 53BP1.
البروتين P53 ملزم 1 (53BP1) يموضع إلى مناطقDSBs عن طريق الربط بين تعديل الهستونات 3،4، وتشكيل بؤر داخل 5-15 دقائق 5. ويعتقد أن التعديلات هيستون والتوظيف من البروتينات وغيرها من DDR 53BP1 إلى مواقع DSB لتسهيل إعادة ترتيب الهيكلية للونين حول مناطق الضرر والمساهمة في إصلاح الحمض النووي 6. إلى ما بعد المشاركة المباشرة في الإصلاح، وقد وصفت أدوار إضافية ل53BP1 في DDR، مثل تنظيم داخل نقطة تفتيش تابعة لل-S، G2 نقطة تفتيش / M، وتفعيل المصب البروتينات DDR 7-9. مؤخرا، تم اكتشاف أن 53BP1 لا تشكل بؤر ردا على الحمض النووي من التلف الناجم أثناء الانقسام، والانتظار بدلا من ذلك لدخول الخلايا G1 قبل إضفاء الطابع المحلي على مقربة من DSBs 6. تم العثور على البروتينات مثل DDR 53BP1 لربط مع الهياكل الإنقسامية (مثل kinetochores) خلال التقدم من خلال الانقسام 10.
ونحن في هذا البروتوكول وصف استخدام 2 – 3-D والتصوير الخلية الحية لتصورتشكيل بؤر 53BP1 ردا على وكيل camptothecin DNA الضارة (CPT)، وكذلك السلوك 53BP1 خلال الانقسام. Camptothecin هو topoisomerase I المانع الذي يسبب في المقام الأول DSBs خلال تكرار الحمض النووي. لإنجاز هذا، استخدمنا الموصوفة سابقا 53BP1-mCherry انصهار بروتين فلوري بناء يتألف من مجال البروتين 53BP1 قادرة على ربط DSBs 11. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا هيستون H2B-GFP البروتين الانصهار الفلورسنت بناء قادرة على رصد ديناميات ونين في جميع أنحاء دورة الخلية ولكن بشكل خاص خلال الانقسام 12. الحية التصوير خلية في أبعاد متعددة هو أداة ممتازة لتعميق فهمنا لوظيفة البروتينات في الخلايا حقيقية النواة DDR.
Protocol
Discussion
الحفاظ على سلامة الجينوم هو أمر حاسم لبقاء الخلية. الفشل في الحفاظ على نتائج الجينوم في الشيخوخة المبكرة، التسرطن أو الموت، 8. هناك اهتمام كبير في كيفية عمل المميزين DDR، النابعة من أهميته للبحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. وقد تم تطوير العديد من التقنيات على…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم جزئي من وR01NS064593 R21ES016636 (KV). تم إجراء الفحص المجهري في جامعة فرجينيا كومنولث – قسم البيولوجيا العصبية ومرفق المجهر تشريح، بدعم، في جزء منه، وذلك بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة، مركز NINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية. تم شراء القرص الغزل مبائر المجهر مع جائزة NIH-NCRR (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
