Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l'ADN de réponse
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.
Abstract
Des cassures double brin (CDB) de l'ADN sont les plus délétères des lésions d'une cellule peut rencontrer. Si laissé non réparés, CSD port un grand potentiel pour générer des mutations et des aberrations chromosomiques 1. Pour éviter ce traumatisme de catalyser l'instabilité génomique, il est crucial pour les cellules pour détecter les conseils scolaires de district, activer la réponse dommages à l'ADN (DDR), et réparer l'ADN. Quand ils sont stimulés, la DDR travaille à préserver l'intégrité du génome en déclenchant l'arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation doit avoir lieu ou forcer la cellule à l'apoptose. Les mécanismes prédominants de réparation des CDB se produire par recombinaison non homologue bout de jonction (NHEJ) et la réparation recombinaison homologue (HRR) (révisé en 2). Il existe de nombreuses protéines dont les activités doivent être précisément orchestrée pour le DDR pour fonctionner correctement. Nous décrivons ici une méthode pour le 2 – et 3-dimensions (D) Visualisation d'une de ces protéines, 53BP1.
La protéine p53 lie 1 (53BP1) se localise dans les zones deCDB en se liant aux histones modifiées 3,4, formant des foyers à 5-15 minutes 5. Les modifications des histones et de recrutement de protéines DDR 53BP1 et d'autres vers des sites ORD sont censés faciliter le réarrangement structural de la chromatine autour des zones de dommages et contribuent à 6 réparation de l'ADN. Au-delà de la participation directe à la réparation, des rôles supplémentaires ont été décrits pour 53BP1 dans le DDR, tels que la régulation de un point de contrôle intra-S, un point de contrôle G2 / M, et l'activation de protéines en aval de DDR 7-9. Récemment, on a découvert que 53BP1 ne pas former des foyers en réponse à dommages à l'ADN induits lors de la mitose, au lieu d'attendre pour les cellules à entrer G1 avant de repérer à proximité du CSD 6. DDR protéines telles que 53BP1 ont été trouvés à associer avec des structures mitotiques (comme kinétochores) au cours de la progression à travers la mitose 10.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de 2 – et 3-D imagerie des cellules vivantes pour visualiserla formation de foyers 53BP1 en réponse à l'agent de détérioration d'ADN camptothécine (CPT), ainsi que le comportement de 53BP1 lors de la mitose. La camptothécine est un inhibiteur de topoisomérase I qui provoque principalement CDB lors de la réplication d'ADN. Pour ce faire, nous avons utilisé un décrit précédemment 53BP1-mCherry protéine de fusion fluorescente construire composée d'un domaine protéique 53BP1 capable de se lier CDB 11. En outre, nous avons utilisé une histone H2B-GFP protéine de fusion fluorescente construire en mesure de suivre la dynamique de la chromatine au long du cycle cellulaire, mais en particulier lors de la mitose 12. Imagerie des cellules vivantes dans des dimensions multiples est un excellent outil pour approfondir notre compréhension de la fonction des protéines de DDR dans les cellules eucaryotes.
Protocol
Discussion
Maintien de l'intégrité génomique est essentielle à la survie cellulaire. Le défaut de préserver les résultats du génome dans le vieillissement prématuré, la carcinogenèse, ou la mort 8. Il ya un intérêt intense pour discerner comment les fonctions de DDR, découlant de son importance à la recherche fondamentale et clinique. De nombreuses techniques ont été développées au fil des ans afin d'aider à l'étude de la façon dont les cellules détecter et réparer les dommages à l&#…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu en partie par R01NS064593 et R21ES016636 (KV). Microscopie a été réalisée à l'engagement – Département de Neurobiologie de microscopie & anatomie, pris en charge, en partie, grâce au financement du NIH-NINDS Centre cœur 5P30NS047463 subvention. Le microscope confocal à disque rotatif a été acheté avec un prix NIH-NCRR (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
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