Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения
Summary
Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.
Abstract
Двунитевых разрывов (ДР) являются наиболее вредными повреждения ДНК клетки может столкнуться. Если оставить неустраненные, DSBs гавани большой потенциал для создания мутаций и хромосомных аберраций 1. Чтобы предотвратить эту травму от катализирующих геномной нестабильности, крайне важно для клеток для обнаружения DSBs, активировать ответ повреждение ДНК (РДР), и ремонт ДНК. Когда стимулируются, DDR работает, чтобы сохранить целостность генома, вызывая остановку клеточного цикла, чтобы обеспечить ремонт пройдет или заставить клетки к апоптозу. Преобладающий механизм ремонта DSB происходить через негомологичных конце-присоединение (NHEJ) и гомологичной рекомбинации ремонт (HRR) (отзывы в 2). Есть много белков, чья деятельность должна быть четко организованы для DDR функционировать должным образом. Здесь мы опишем метод для 2 – и 3-мерные (D) визуализация одного из этих белков, 53BP1.
P53-связывающий белок 1 (53BP1) локализуется в областиDSBs путем связывания изменение гистонов 3,4, образуя очаги в течение 5-15 минут 5. Модификации гистонов и вербовки 53BP1 и других белков DDR для DSB сайтов, как полагают, содействие структурной перестройке хроматина вокруг области повреждения и способствуют репарации ДНК 6. Помимо непосредственного участия в ремонте, дополнительные роли были описаны для 53BP1 в ГДР, например, регулирование внутри-S контрольно-пропускном пункте, G2 / M контрольно-пропускного пункта, и активация белка ниже по течению DDR 7-9. Недавно было обнаружено, что 53BP1 не образует очаги в ответ на повреждение ДНК индуцированных во время митоза, вместо ожидания для клеток, чтобы войти G1 до локализации в окрестности DSBs 6. DDR белки, такие как 53BP1 были найдены общаться с митотической структур (таких, как кинетохоры) во время их прохождения митоза 10.
В этом протоколе описываются использования 2 – и 3-D изображений живых клеток, чтобы визуализироватьформирование 53BP1 очагов в ответ на ДНК-повреждающих агентов камптотецин (CPT), а также поведение 53BP1 во время митоза. Камптотецин является ингибитором топоизомеразы I, что в первую очередь вызывает DSBs во время репликации ДНК. Для этого мы использовали ранее описанных 53BP1-mCherry флуоресцентный белок слияния построить, состоящий из 53BP1 домена белка способен связывать DSBs 11. Кроме того, мы использовали гистона H2B-GFP флуоресцентный белок слияния построить в состоянии контролировать динамику хроматина протяжении клеточного цикла, но, в частности, во время митоза 12. Изображений живых клеток в нескольких измерениях является отличным инструментом для углубления нашего понимания функции белков DDR в эукариотических клетках.
Protocol
Discussion
Поддержание целостность генома имеет решающее значение для выживания клеток. Неспособность сохранить геном приводит к преждевременному старению, канцерогенеза, или смерть 8. Существует повышенный интерес взыскательных как DDR функций, вытекающих из его значение как фундаментал?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При частичной поддержке R01NS064593 и R21ES016636 (KV). Микроскопия была выполнена в VCU – отдел фонда микроскопии нейробиологии и анатомии, поддерживается, в частности, с финансированием из NIH-NINDS центра основного гранта 5P30NS047463. Вращающийся диск конфокальной микроскопии был приобретен с NIH-NCRR премии (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
