Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten
Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.
Abstract
Dubbel-breuken (DSB's) zijn de meest schadelijke DNA laesies een cel tegenkomt kan. Als gerepareerd wordt aan DSB haven een groot potentieel genereren mutaties en chromosomale afwijkingen 1. Om dit trauma te voorkomen katalyseren genomische instabiliteit, is het cruciaal voor de cellen om DSB's te detecteren, activeert u de DNA schade respons (DDR), en herstellen het DNA. Wanneer gestimuleerd, de DDR werkt om genomische integriteit te bewaren door het triggeren van de celcyclus te laten voor reparatie te laten plaatsvinden of dwingen de cel om apoptose te ondergaan. De overheersende mechanismen van DSB reparatie plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie reparatie (HRR) (beoordeeld in 2). Er zijn veel eiwitten waarvan de activiteiten moet nauwkeurig worden georkestreerd voor de DDR om goed te functioneren. Hierin beschrijven we een werkwijze voor 2 – en 3-dimensionale (D) visualisatie van een van deze eiwitten, 53BP1.
De p53-binding protein 1 (53BP1) gelokaliseerd op gebieden vanDSB's door te binden aan gemodificeerde histonen 3,4, die foci binnen 5-15 minuten 5. De histon modificaties en werving van 53BP1 en andere DDR eiwitten aan DSB sites worden verondersteld om de structurele herschikking van chromatine te vergemakkelijken rond gebieden van schade en om DNA herstel 6 bijdragen. Naast directe participatie in reparatie zijn aanvullende rollen zijn beschreven voor 53BP1 in de DDR, zoals de regeling van een intra-S checkpoint, een G2 / M checkpoint, en het activeren van stroomafwaarts DDR eiwitten 7-9. Onlangs werd ontdekt dat 53BP1 geen foci in reactie op DNA schade geïnduceerd tijdens mitose, maar wachten cellen G1 voeren voordat lokaliseren naar de omgeving van DSB 6. DDR eiwitten zoals 53BP1 zijn gevonden met mitotische structuren (zoals kinetochoren) betrekken bij het doorlopen van mitose 10.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van 2 – en 3-D beeldvorming van levende cellen te visualiserende vorming van 53BP1 foci in reactie op de DNA beschadigende middel camptothecine (CPT), alsmede 53BP1 gedrag tijdens mitose. Camptothecine is een topoisomerase-I-remmer die voornamelijk DSB veroorzaakt tijdens DNA replicatie. Hiervoor hebben we een eerder beschreven 53BP1-mCherry fluorescent eiwit constructie bestaande uit een 53BP1 eiwitdomein kunnen DSB 11 binden. Daarnaast gebruikten we een histon H2B-GFP fusie-eiwit construct fluorescent kunnen chromatine dynamiek tijdens de gehele celcyclus maar vooral tijdens mitose 12. Live cell imaging in meerdere dimensies is een uitstekend hulpmiddel om ons begrip van de functie van DDR eiwitten in eukaryotische cellen te verdiepen.
Protocol
Discussion
Onderhoud van genomische integriteit is cruciaal voor overleving van de cel. Als de genoom resultaten te bewaren in vroegtijdige veroudering, kanker, of de dood 8. Er is grote belangstelling in het onderscheiden van de manier waarop de DDR functies, als gevolg van het belang ervan voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Vele technieken zijn ontwikkeld de afgelopen jaren om te helpen bij het bestuderen van cellen te detecteren en repareren DNA schade. Traditionele methoden zoals immunocytochemie en wes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mede ondersteund door R01NS064593 en R21ES016636 (KV). Microscopie werd uitgevoerd bij de VCU – Departement Neurobiologie en Anatomie Microscopie Facility, ondersteund, voor een deel, met financiering van NIH-NINDS Center kern subsidie 5P30NS047463. De draaiende schijf confocale microscoop werd aangeschaft met een NIH-NCRR award (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
