A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Abstract

Dubbel-breuken (DSB's) zijn de meest schadelijke DNA laesies een cel tegenkomt kan. Als gerepareerd wordt aan DSB haven een groot potentieel genereren mutaties en chromosomale afwijkingen ^1. Om dit trauma te voorkomen katalyseren genomische instabiliteit, is het cruciaal voor de cellen om DSB's te detecteren, activeert u de DNA schade respons (DDR), en herstellen het DNA. Wanneer gestimuleerd, de DDR werkt om genomische integriteit te bewaren door het triggeren van de celcyclus te laten voor reparatie te laten plaatsvinden of dwingen de cel om apoptose te ondergaan. De overheersende mechanismen van DSB reparatie plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie reparatie (HRR) (beoordeeld in ^2). Er zijn veel eiwitten waarvan de activiteiten moet nauwkeurig worden georkestreerd voor de DDR om goed te functioneren. Hierin beschrijven we een werkwijze voor 2 – en 3-dimensionale (D) visualisatie van een van deze eiwitten, 53BP1.

De p53-binding protein 1 (53BP1) gelokaliseerd op gebieden vanDSB's door te binden aan gemodificeerde histonen ^3,4, die foci binnen 5-15 minuten ^5. De histon modificaties en werving van 53BP1 en andere DDR eiwitten aan DSB sites worden verondersteld om de structurele herschikking van chromatine te vergemakkelijken rond gebieden van schade en om DNA herstel ⁶ bijdragen. Naast directe participatie in reparatie zijn aanvullende rollen zijn beschreven voor 53BP1 in de DDR, zoals de regeling van een intra-S checkpoint, een G2 / M checkpoint, en het activeren van stroomafwaarts DDR eiwitten ^7-9. Onlangs werd ontdekt dat 53BP1 geen foci in reactie op DNA schade geïnduceerd tijdens mitose, maar wachten cellen G1 voeren voordat lokaliseren naar de omgeving van DSB ^6. DDR eiwitten zoals 53BP1 zijn gevonden met mitotische structuren (zoals kinetochoren) betrekken bij het ​​doorlopen van mitose ^10.

In dit protocol beschrijven we het gebruik van 2 – en 3-D beeldvorming van levende cellen te visualiserende vorming van 53BP1 foci in reactie op de DNA beschadigende middel camptothecine (CPT), alsmede 53BP1 gedrag tijdens mitose. Camptothecine is een topoisomerase-I-remmer die voornamelijk DSB veroorzaakt tijdens DNA replicatie. Hiervoor hebben we een eerder beschreven 53BP1-mCherry fluorescent eiwit constructie bestaande uit een 53BP1 eiwitdomein kunnen DSB ¹¹ binden. Daarnaast gebruikten we een histon H2B-GFP fusie-eiwit construct fluorescent kunnen chromatine dynamiek tijdens de gehele celcyclus maar vooral tijdens mitose ^12. Live cell imaging in meerdere dimensies is een uitstekend hulpmiddel om ons begrip van de functie van DDR eiwitten in eukaryotische cellen te verdiepen.

Protocol

A. Bereiding Cell Normale humane primaire fibroblasten (GM02270) werden verkregen van Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, en geïmmortaliseerd met hTERT 6. Cellen werden gekweekt en uitgebreid CellStar 6 cm schalen in media (4 ml) bestaande uit MEM aangevuld met 20% foetaal runderserum (GIBCO), non-essential/essential aminozuren, vitaminen, natriumpyruvaat, en penicilline / streptomycine (HyClone ). Humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen werden verkregen van American Type Culture Collection en gekweekt en uitgebreid in CellStar 6 cm schalen. De cellen werden in media (4 ml) bestaande uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, niet-essentiële aminozuren, L-glutamine en penicilline / streptomycine. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT PLPC-Puro; Addgene plasmide 19836) en H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plasmide 17735) fusiegen constructen ook expressie puromycine of G418 resistentie genen, respectievelijk, werden getransduceerd (fibroblast) of getransfecteerde (HEK293) met behulp van SuperFect (Qiagene) in cellen en onderhouden onder drug selectie. Onderhoud van fluorescentie werd regelmatig worden gecontroleerd. 24 tot 48 uur voor beeldacquisitie, werden de cellen met trypsine behandeld in een single-celsuspensie en uitgezet met een lage dichtheid op 3,5-cm FluroDish glazen bodem platen. B. Microscoop Setup en Image Acquisition Dit protocol is ontwikkeld met behulp van de Zeiss Cell Observer SD draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met een AxioObserver Z1 stand, een dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 draaiende schijf-eenheid, 2 Photometrics QuantEM 512SC EMCCD camera's, een HXP 120C vezel-gebaseerde verlichting, 4 lasers (een Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diode, 40 mW 561 nm diode, en 30 mW 635 nm diode), AOTF, een Pecon XL multiS1 stadium incubatie-systeem, Zeiss incubatie modules (O 2-module S, CO 2 Module S, TempModule S, Verwarming Unit XL S) en een Prior motorized XY podium met een NanoScanZ piëzo Z insert. Sferische aberraties te minimaliseren terwijl imaging levende cellen ondersteund in een waterig medium, een C-Apochromat 63x/1.20 Water / Corr objectieflens en Zeiss Immersol W onderdompeling vloeistof (met een brekingsindex n = 1,334) gebruikt. Voor 2-kanaals confocale beeldvorming, een RQFT 405/488/568/647 dichroïsche spiegel en BP525/50 (groen) en BP629/62 (rood) emissie filters werden gebruikt. Het gebruikte systeem software was Zeiss AxioVision (versie 4.8.2.0) met AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fysiologie, MosaiX, Mark & ​​Find, Dual Camera, Inside 4D, Autofocus en 3-D Deconvolutie modules. Zorg ervoor dat de CO 2-gas draait om de CO 2-module van de incubatie-systeem. Als de microscoop wordt ondersteund door een anti-vibratie lucht tafel, zet de luchttoevoer (of N 2 gas) voor de lucht tafel. Schakel de stroom in voor de microscoop stand, draaiende schijf-eenheid, camera's, incubatie modules, HXP verlichting, gemotoriseerde podium, Argonlaser, en de computer. Na 1 min van warm-up tijd, draai de contactsleutel voor de Argon laser op "Aan". Op Zeiss laser bedieningspaneel zet de schakelaars voor de laserlijnen worden gebruikt. Zet de tuimelschakelaar voor de Lasos Argon laser controller van "stand-by" op "laser run" en stel het licht controller om het optimale niveau (dwz net onder het punt waar de groene indicator wordt rood). Start de AxioVision software. Opmerking: de gebruikersinterface voor AxioVision kunnen worden aangepast met ramen en pull-down menu's die specifiek zijn voor de betreffende microscoop en componenten die ze controleert. Als zodanig elk systeem een ​​potentieel unieke interface. Daarom zijn algemene instructies voor software manipulatie die in de volgende stappen, in plaats van aanwijzingen voor specifieke software vensters, tabs en / of pull-down menu's. Ongeveer 1 uur voorafgaand aan de beeldvorming, in de software, zoekt u de controles voor de incubator enSchakel de verwarming van de bovenste kamer en de objectplaat. Stel de temperatuur tot 37 ° C. Zet de CO 2-regelaar en stel het niveau van 5%. Selecteer de objectieflens voor beeldvorming. In deze studie werd een C-NA 63x/1.20 Apochromat Water / Corr objectieflens gebruikt. Opmerking: Voor deze lens, een onderdompeling medium met een brekingsindex gelijk aan water (Zeiss Immersol W onderdompeling vloeistof) nodig. Als meerdere afzonderlijke posities worden bemonsterd gedurende een lange periode, bepaald om een ​​voldoende hoeveelheid medium onderdompeling toepassing opdat zij vervoerd van de ene positie naar de andere. Zet de schaal op het podium en breng de objectieflens omhoog in contact met de bodem. Met behulp van de microscoop controles of de software, direct het uitgestraalde licht van de oculairs en selecteer de juiste groothoek filter instellen voor het fluorescerende signaal van belang (voor deze studie, "Red" filter instellen voor 53BP1 en een "GFP" filter instellen voor H2B ). </ Li> Bekijk via de oculaire lenzen, de focus van de afbeelding, en zoek een geschikte gebied van de cellen. Met behulp van de software of de microscoop controles, richt het uitgestraalde licht weg van de oculairs naar de haven met de confocale draaiende schijf unit. In de software, het inschakelen van de juiste laser (voor deze studie, de 561 nm laser voor 53BP1 en de 488 nm lijn van de Argon laser voor H2B). Voor elk kanaal de intensiteit van de laser door aanpassing van de acousto-optische afstembaar filter (AOTF) control naar een geschikt niveau. Selecteer de juiste dichroïsche spiegel (RQFT 405/488/568/647) en emissie filters (BP 629/62 voor 53BP1 en BP 525/50 voor H2B). Open het schuifje van de draaiende schijf unit. Selecteer de "Live" venster om de huidige gezichtsveld weer te geven. In de software, opent u het "Camera" controle, selecteert u de camera moet worden gebruikt (als een dubbele camera-systeem) en stel de belichtingstijd van ongeveer 100 ms. Stel de% en EM systeem krijgen als neg. essary Opmerking: De 53BP1-mCherry constructie lijkt wat afm. We vonden het nuttig om de EM winst te verhogen. In de software, opent u de controle voor de confocale draaiende schijf-eenheid en pas de draaiende schijf snelheid door het invoeren van de juiste belichting tijd die is ingesteld op een geschikt beeld (bijvoorbeeld ~ 100 ms) vast te leggen. Klik op "Set" te vergrendelen in de verandering. Open "multi-dimensionale overname". Selecteer het kanaal tab en laadt / selecteer de juiste kanalen. Voor dit onderzoek gebruiken we kanalen gedefinieerd voor DsRed (561 nm laser excitatie en BP 629/62 filter voor emissie) en GFP (488 nm laser lijn voor excitatie en BP525/50 filter voor emissie). Om beeldregistratie te verzekeren, werd een gemeenschappelijke dichroïsche spiegel (RQFT 405/488/568/647) gebruikt voor beide kanalen. Stel de software om "Autofocus". Opmerking: Ga naar Extra → Instellingen editor om de MDA instellingen aan te passen. Zorg ervoor dat er voldoende laservermogen is ingesteld ("Adequate laservermogen" verwezen naar een instelling die u in staat steltde passende fluorofoor wekken met minimale foto-bleking). In het MDA-venster, selecteer de z-stack tabblad. Selecteer "Z-stack op de actieve focus positie". Stel het bereik voor ~ 10 pm z-stack en kies "optimale" voor het aantal stappen om Nyquist bemonstering te garanderen door middel van Z. Opmerking: De exacte omvang van de z-stack is afhankelijk van de hoogte van uw cellen. Dienovereenkomstig aan te passen. 23. Klik op "Start" en analyseren de resulterende z-stack beeld om ervoor te zorgen de instellingen geschikt zijn voor wat je aan het onderzoeken (bijvoorbeeld in deze studie, was het belangrijk om het imago van de hele kern). Selecteer de "T" (tijd) aan. Voor onze experimenteren met camptothecine, zetten we het interval tussen beeldvorming tijdstippen tot 5 minuten en de totale duur van de sessie gedurende 1 uur voor een controle (niet-behandelde cellen) video. Let op: het minimaliseren van foto-bleken van de cellen, het experiment worden geconfigureerd dat de AOTF spaties tussen de laser imaging tijdstippen. Fof multi-point imaging van meerdere cellen in de schaal, in het MDA-venster, selecteer het tabblad Positie. Zorg ervoor dat "Apply"-instelling voor / na tijdstip 'per positie "is aangevinkt. Selecteer "Mark_Find". Het gebruik van de "Live" uitzicht, bewegen de schotel en selecteer de juiste gezichtsveld. Klik op "Start" in de multi-dimensionale-overname menu om het experiment te starten en een controle video op te nemen (van onbehandelde cellen). Na de controle video, voeg de geschikte behandeling (in dit geval 10 uM camptothecine). We namen de experimentele (drug-behandelde cellen) video op een 5-10 minuten intervallen gedurende 2-4 uur. Let op: Een belangrijk punt om te overwegen is de snelheid waarmee een bepaalde effect treedt op na de behandeling. Zoals te zien in de video, 53BP1 foci gaan van ~ 5 min na toevoeging van CPT. Hoewel een relatief eenvoudig proces, het toevoegen van medicijnen om de schotel handmatig en opnieuw kalibreren van de microscoop vergt wel tijd. Aandacht dient te worden besteed aan dit bij het ontwerpen van experimenten. Voor het monitoren van mitosis, we het interval op 7,5 min en opgeslagen gedurende 4-5 uur (de specifieke instellingen afhankelijk van de gebruikte cellijn en de lengte van de celcyclus). Aanpassingen moeten mogelijk worden gemaakt om foto-bleken te voorkomen tijdens langere opnames. C. Image Processing and Analysis Dit protocol is ontwikkeld met behulp van Volocity software (PerkinElmer). De software gebruikt om deze gegevens (AxioVision) verwerven heeft ook de mogelijkheid te verwerken en analyseren beelden. Gebruikers worden aangemoedigd om de beschikbare software om ze te gebruiken, en passende literatuur betreffende de toepassing ervan te raadplegen. Open Volocity software. Maken en een naam van een nieuwe bibliotheek, en importeer uw video-bestanden. Voor het bekijken van de bestanden, hebben we meestal vinden het zeer nuttig om de "Extended Focus"-instelling te gebruiken. Dit superponeert de z-stack plakjes en, voor dit protocol, kunnen we 53BP1 foci te visualiseren in verschillende gebieden van de kern. Pas video's als dat nodig is. Volocity is uitgerust met een scala aan tools om de kwaliteit van verkregen beelden te verbeteren. Door te zorgen voor de instellingen op de microscoop adequaat waren, kan veel tijd worden bespaard in het bewerken van later. Vaak is het nuttig om uw foto's Deconvolutie, en de helderheid / contrast aan te passen. Uw specifieke bewerking behoeften zal variëren op basis van het experiment. Voeg een relatieve tijdstempel en schaal bar. Om cellen te bekijken in 3-D, schakelen naar de "3-D Dekking" instelling. Dit maakt rotatie van de 3-D teruggegeven cellen in de ruimte, waardoor meerdere perspectieven van structuren plaats binnen de cellen. Opmerking: Het is nuttig om cellen te visualiseren in verschillende vlakken bepalen waar structuren plaats reizen. Bijvoorbeeld, in de "Extended Focus" moeilijk te onderscheiden dat de 53BP1 is in feite van DNA dissociëren tijdens mitose. Dit is echter duidelijk zichtbaar in 3-D. Films en stilstaande beelden kunnen worden geëxporteerd naar een groot aantal bestandstypen op basis van voorkeur van de gebruiker. </l i> D. Representatieve resultaten Een voorbeeld van 53BP1 foci vorming in respons op CPT is weergegeven in figuur 1. Cellen blootgesteld aan CPT vorm foci binnen 5-10 min en handhaven deze foci gehele duur van opname. Zoals getoond in figuur 2, 53BP1 dissocieert van chromatine bij het ​​begin van mitose, vormen van een dunne waas rond de condenserende chromosomen. Als telofase optreedt en mitose tot een einde komt, 53BP1 opnieuw aggregaten in verschillende brandpunten. Terwijl de HEK293 cellen werden niet blootgesteld aan CPT, niettemin gevormd overvloedig spontane 53BP1 reparatie foci geproduceerd door endogene DNA schade. Deze observatie konden we concluderen dat 53BP1 niet foci te vormen tijdens de vroege mitose, in lijn met een eerder rapport met een vergelijkbaar effect na de blootstelling van cellen aan ioniserende straling en radiomimetische drugs 5. ure 1 "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/> Figuur 1. Camptothecine (10 uM) veroorzaakt DSB en 53BP1 foci vorming in fietsen fibroblasten binnen 30 min van toevoeging van het geneesmiddel aan het medium. Figuur 2. 53BP1 geen foci te vormen tijdens mitose tot telophase/G1 in HEK293 cellen.

Discussion

Onderhoud van genomische integriteit is cruciaal voor overleving van de cel. Als de genoom resultaten te bewaren in vroegtijdige veroudering, kanker, of de dood ^8. Er is grote belangstelling in het onderscheiden van de manier waarop de DDR functies, als gevolg van het belang ervan voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Vele technieken zijn ontwikkeld de afgelopen jaren om te helpen bij het bestuderen van cellen te detecteren en repareren DNA schade. Traditionele methoden zoals immunocytochemie en wes…

Materials

CellStar culture dishes	Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes	World Precision Instruments, Inc.
MEM media	GIBCO
Non-essential amino acids	GIBCO
Amino acids	GIBCO
Vitamins	GIBCO
Sodium Pyruvate	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;<br/> plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system	Zeiss
AxioVision (release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity software (version 6.0)	PerkinElmer