Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å visualisere en DNA dobbel tråd pause signal protein aktiveres i respons til DNA-skade, så vel som dens lokalisering under mitose.
Abstract
Double-tråd pauser (DSBs) er den mest skadelige DNA lesjoner en celle kan støte på. Hvis venstre unrepaired, til DSBs havn stort potensial generere mutasjoner og kromosomabberasjoner en. For å forhindre dette traumer fra katalyserende genomisk ustabilitet, er det avgjørende for cellene å oppdage DSBs, aktivere DNA skade respons (DDR), og reparere DNA. Når stimulert, fungerer DDR å bevare genomisk integritet ved å utløse cellesyklus å tillate reparasjon å finne sted eller tvinge cellen til å gjennomgå apoptose. De dominerende mekanismer for DSB reparasjon skje gjennom ikkehomologe end-delta (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) (anmeldt i 2). Det er mange proteiner hvis aktiviteter må være nøyaktig orkestrert for DDR å fungere skikkelig. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for 2 - og 3-dimensjonale (D) visualisering av en av disse proteinene, 53BP1.
P53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliserer til områder avDSBs ved binding til endrede histoner 3,4, forming foci innen 5-15 minutter 5. De histonmodifikasjonene og rekruttering av 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB områder antas å lette de strukturelle omleggingen av kromatin rundt områder av skade og bidra til DNA-reparasjon 6. Utover direkte deltakelse i reparasjon, har flere roller er beskrevet for 53BP1 i DDR, som regulerer en intra-S sjekkpunkt, en G2 / M sjekkpunkt, og aktivere nedstrøms DDR proteiner 7-9. Nylig ble det oppdaget at 53BP1 ikke danner foci i respons til DNA-skade indusert ved mitose, istedenfor å vente på celler å angi G1 før lokalisere til nærhet av DSBs 6. DDR proteiner som 53BP1 har blitt funnet til å assosiere med mitotiske strukturer (for eksempel kinetochores) under progresjon gjennom mitose 10.
I denne protokollen beskriver vi bruk av 2 - og 3-D live celle imaging å visualiseredannelsen av 53BP1 foci i respons til DNA-skade agenten camptothecin (CPT), samt 53BP1 oppførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I-inhibitor som primært forårsaker DSBs under DNA replikasjon. For å oppnå dette, brukte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusjonsprotein konstruere består av en 53BP1 protein domene stand til å binde DSBs 11. I tillegg brukte vi en histone H2B-GFP fluorescerende fusjonsprotein konstruere stand til å overvåke kromatin dynamikk gjennom hele cellesyklus, men særlig under mitose 12. Levende celle bildebehandling i flere dimensjoner er et utmerket verktøy for å utdype vår forståelse av funksjon av DDR proteiner i eukaryote celler.
Protocol
A. celleforberedelsen
- Normale primære fibroblaster (GM02270) ble hentet fra Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, og foreviget med hTERT 6. Cellene ble dyrket og utvidet i CellStar 6-cm retter i media (4 ml) som består av MEM supplert med 20% føtalt bovint serum (Gibco), non-essential/essential aminosyrer, vitaminer, natrium pyruvat, og penicillin / streptomycin (HyClone ).
- Humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket og utvidet i CellStar 6-cm retter. Cellene ble holdt i media (4 ml) bestående av DMEM supplert med 10% fetalt bovint serum, ikke-essensielle aminosyrer, L-glutamin, og penicillin / streptomycin.
- 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro, Addgene plasmid 19836) og H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene plasmid 17735) fusion genet konstruerer også uttrykke puromycin eller G418 resistensgener, henholdsvis, ble omformet (fibroblam) eller transfekterte (HEK293) med SuperFect (Qiagene) inn i celler og vedlikeholdes i henhold til narkotika valg. Vedlikehold av fluorescens ble regelmessig kontrollert.
- 24-48 time før bildeopptak, ble cellene trypsinert i en enkelt-cellesuspensjon og sås med en lav tetthet på 3,5-cm FluroDish glass bunnplater.
B. mikroskop Oppsett og Image Acquisition
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Zeiss Cell Observer SD spinne disk confocal mikroskop utstyrt med en AxioObserver Z1 stand, en dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 spinne disk enhet, 2 Fotometri QuantEM 512SC emCCD kameraer, en HXP 120C fiberbasert illuminator, 4 lasere (a Lasos 100mW flerlinjet Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diode, 40 mW 561 nm diode, og 30 mW 635 nm diode), AOTF, en Pecon XL multiS1 scenen inkubasjon system, Zeiss inkubering moduler (O 2 Modul S, CO 2 Modul S, TempModule S, Oppvarming Unit XL S) og en tidligere motorized XY scenen med en NanoScanZ piezo Z innsatsen. Å minimalisere sfæriske aberrasjoner mens bildebehandling levende celler støttet i et vandig medium, en C-Apochromat 63x/1.20 Vann / Corr objektivlinsen og Zeiss Immersol W nedsenking væske (med en brytningsindeks n = 1,334) ble anvendt. For 2 kanals confocal imaging, en RQFT 405/488/568/647 dichroic speil og BP525/50 (grønn) og BP629/62 (rød) utslipp filtre ble brukt. Systemprogramvaren som ble brukt var Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) med AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, fysiologi, MosaiX, Mark & Finn, Dual Kamera, Inside 4D, Autofokus og 3-D dekonvolusjon moduler.
- Sørg for at CO 2 gass kjører til CO 2 Modul av inkuberingen systemet. Hvis mikroskop er støttet av en anti-vibrasjon luft tabellen, slår du på lufttilførselen (eller N 2 gass) for luft tabellen.
- Slå på strømmen for mikroskopstativet, spinning disk enhet, kameraer, inkubasjon moduler, HXP illuminator, motorisert stadium, Argonlaser, og datamaskinen.
- Etter 1 min av oppvarmingstid, vri om tenningsnøkkelen for Argon laser til "On".
- På Zeiss laser kontrollpanelet, slå på bryterne for laserlinjer skal brukes.
- Slå bryteren for Lasos Argon laser kontrolleren fra "standby" til "laser run" og juster lyset kontrolleren til det optimale nivået (dvs. like under det punktet hvor den grønne indikatoren blir rød).
- Start opp AxioVision programvare. Merk: brukergrensesnittet for AxioVision kan tilpasses med vinduer og pull-down menyer som er spesifikke for den enkelte mikroskop og komponenter som den kontrollerer. Som sådan, har hvert system en potensielt unike grensesnitt. Derfor er generelle instruksjoner for programvare manipulasjon gitt i etterfølgende trinn, snarere enn retninger for spesifikke programvare vinduer, faner og / eller trekk-ned menyer.
- Omtrent 1 time før bildebehandling, i programvaren, finner kontrollene for inkubator ogslå på varme for det øvre kammer og scenen plate. Still temperaturen til 37 ° C. Slå på CO 2 kontroll og sette nivået på 5%.
- Velg objektiv for bildebehandling. I denne studien ble det 63x/1.20 NA C-Apochromat Vann / Corr objektiv brukt Merk:. For dette objektivet, er en nedsenking medium med en brytningsindeks lik vann (Zeiss Immersol W nedsenking væske) nødvendig.
- Hvis flere separate posisjoner er som skal avsøkes over en lang periode, være sikker på å anvende en tilstrekkelig mengde av nedsenking middels å sikre at det føres fra en stilling til en annen.
- Sett formen på scenen og bringe objektivlinsen opp i kontakt med bunnen.
- Med enten mikroskop kontroller eller programvaren, dirigere lyset til okularene og velg riktig Widefield filter satt for fluorescerende signal av interesse (for denne studien, "Red" filter satt for 53BP1 og en "GFP" filter satt for H2B ). </ Li>
- Vis gjennom okulære linser, fokusere bildet, og finne en passende felt av celler.
- Bruk enten programvaren eller mikroskop kontroller, rette lyset bort fra okularene til porten med den confocal roterende plate enhet.
- I programvaren, slå på den aktuelle laseren (for denne studien, 561 nm laser for 53BP1 og 488 nm linjen i Argon laser for H2B).
- For hver kanal justere intensiteten av laser ved å justere den akusto-optic tunbare filter (AOTF) kontroll til et passende nivå.
- Velg riktig dichroic speil (RQFT 405/488/568/647) og utslipp filtre (BP 629/62 for 53BP1 og BP 525/50 for H2B). Åpne lukkeren til den roterende disken enheten.
- Velg "Live"-vinduet for å vise gjeldende synsfelt.
- I programvaren, åpne "Camera" kontroll, merker at kameraet skal brukes (hvis en to kamera system) og fastsette eksponeringen tid til ca 100 ms. Juster% og EM få så nec. unødig Merk: 53BP1-mCherry konstruere vises noe dim. Vi fant det nyttig å øke EM gevinst.
- I programvaren, åpner kontrollen for confocal roterende plate enhet og justere roterende plate hastighet ved å skrive inn kameraet eksponeringstid som ble satt til å ta et passende bilde (f.eks ~ 100 ms). Klikk på "Set" for å låse i endring.
- Åpne "multi-dimensjonale erverv". Velge kanal kategorien og laste / velg riktige kanaler. For denne studien bruker vi definerte kanaler for dsRed (561 nm laser eksitasjon og BP 629/62 filter for utslipp) og GFP (488 nm laser linje for eksitasjon og BP525/50 filter for utslipp).
- For å sikre image registrering, ble en felles dichroic speil (RQFT 405/488/568/647) som brukes for begge kanaler. Satt opp programvaren for "autofokus". Merk: Gå til Verktøy → Innstillinger editor for å justere MDA innstillinger. Sikre at tilstrekkelig laser makt er satt ("Tilstrekkelig laser makt" viser til en innstilling som gjør at duå opphisse den aktuelle fluoroforen samtidig minimere foto-bleking).
- I MDA-vinduet velger du z-stack kategorien. Velg "Z-stack på nåværende fokus posisjon". Angi området for ~ 10 mm z-stack og velg "optimal" for antall skritt for å sikre Nyquist sampling gjennom Z. Merk: Den eksakte størrelsen på z-stack vil avhenge av høyden på cellene dine. Justeres tilsvarende.
- 23. Klikk "Start" og analysere den resulterende z-stack bildet for å sikre at innstillingene er riktige for det du undersøker (f.eks i denne studien, var det viktig å avbilde hele kjernen).
- Velg "T" (tid)-kategorien. For vår eksperimentere med camptothecin, setter vi intervallet mellom tenkelig tidspunkter til 5 min og den totale varigheten av sesjon for 1 hr for en kontroll (ikke-behandlede celler) video Merk:. Å minimere foto-bleking av cellene, eksperimentet må konfigureres slik at AOTF tømmer laser mellom bildebehandling tidspunkter.
- Feller multi-point avbildning av flere celler i parabolen, i MDA-vinduet velger du posisjonen kategorien. Sikre "Apply"-innstillingen før / etter tidspunkt 'per stilling "er avmerket. Velg "Mark_Find". Bruke "Live", flytter fatet rundt og velge passende synsfelt.
- Klikk "Start" i multi-dimensjonale-oppkjøpet menyen for å starte forsøket og ta en kontroll video (av ubehandlede celler).
- Etter kontrollen videoen, legge den passende behandling (i dette tilfellet, 10 uM camptothecin). Vi spilte den eksperimentelle (narkotika-behandlede celler) video på 5-10 min intervaller for 2-4 timers. Merk: Et viktig spørsmål å vurdere er hvor raskt en gitt effekt oppstår etter behandling. Som sett i videoen, 53BP1 foci begynner å fra ~ 5 min etter tilsetning av CPT. Selv om en relativt enkel prosess, og legger stoffet til parabolen manuelt og re-kalibrering av mikroskop tar tid. Det må tas hensyn til dette ved utformingen eksperimenter.
- For overvåking mitosis, setter vi intervallet til 7,5 min, og registrert for 4-5 hr (de spesifikke innstillinger avhengig cellelinje som brukes og lengden av sin cellesyklus). Justeringer må gjøres for å forhindre bilde-bleking under lengre opptak.
C. Bildebehandling og analyse
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Volocity programvare (PerkinElmer). Programvaren som brukes til å skaffe disse dataene (AxioVision) har også muligheten til å behandle og analysere bilder. Brukere oppfordres til å utnytte programvaren tilgjengelig for dem, og konsultere rette litteratur om deres søknad.
- Åpne Volocity programvare. Opprette og navngi et nytt bibliotek, og importere videofiler.
- For å vise filene, vi vanligvis finner det mest nyttig å bruke "Utvidet Focus"-innstillingen. Dette legger på de z-stack skiver og for denne protokollen, tillater oss å visualisere 53BP1 foci i ulike områder av kjernen.
- Juster videoer som er nødvendig. Volocity er utstyrt med en rekke verktøy for å forbedre kvaliteten av ervervede bilder. Ved å sørge for innstillingene på mikroskopet var riktig, kan mye tid lagres i redigering senere. Ofte er det nyttig å deconvolve bildene, og justere lysstyrke / kontrast. Dine spesifikke redigering behov vil variere basert på forsøket.
- Legg til en relativ tidsangivelse og skala bar.
- Å vise celler i 3-D, bytte til "3-D Opacity"-innstillingen. Dette tillater rotasjon av 3-D gjengitt celler i verdensrommet, og dermed gi flere perspektiver av strukturer av interesse innenfor cellene. Merk: Det er nyttig å visualisere celler i forskjellige plan for å bestemme hvor strukturer av interesse for. For eksempel, i "Utvidet Focus" innstillingen er det vanskelig å skjelne at 53BP1 gjør, faktisk, dissosiere fra DNA under mitose. Dette er imidlertid åpenbar i 3-D.
- Filmer og stillbilder kan eksporteres til en rekke filtyper basert på brukerens preferanser. i>
D. Representant Resultater
Et eksempel på 53BP1 foci formasjonen i respons til CPT er vist i figur 1. Celler eksponert for CPT skjema foci innen 5-10 min, og opprettholde disse brennpunktene hele varigheten av opptaket. Som vist i figur 2, 53BP1 dissosierer fra kromatin ved utbruddet av mitose, danner en tynn dis rundt kondenserende kromosomer. Som Telofase oppstår og mitose kommer til en slutt, 53BP1 en gang aggregater inn i forskjellige fokus. Mens HEK293 cellene ikke ble utsatt for CPT, de likevel dannet rikelig, spontan 53BP1 reparasjon foci generert av endogen DNA skade. Denne observasjonen tillatt oss å konkludere med at 53BP1 ikke danner fokus under tidlig mitose, i tråd med en tidligere rapport som viser en lignende effekt etter eksponering av celler til ioniserende stråling og radiomimetic narkotika 5.
ure en "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
Figur 1. Camptothecin (10 mikrometer) fører DSBs og 53BP1 foci formasjon i sykling fibroblaster innen 30 min med å legge stoffet til mediet.
Figur 2. 53BP1 ikke danner foci ved mitose inntil telophase/G1 i HEK293 celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vedlikehold av genomisk integritet er avgjørende for celle overlevelse. Unnlatelse av å bevare genom resultater i for tidlig aldring, kreft eller død 8. Det er stor interesse i kresne hvordan DDR funksjoner, som stammer fra dens betydning for både grunnforskning og klinisk forskning. Mange teknikker har blitt utviklet gjennom årene for å hjelpe i studiet av hvordan celler oppdage og reparere DNA-skader. Tradisjonelle metoder som immunocytokjemi og vestlige blotting har vært bærebjelkene i feltet, men de siste fremskritt innen teknologi har tillatt stadig mer sofistikerte metoder for å utvikle seg. Lever celle bildebehandling, som beskrevet i denne protokollen, tillater oss å studere egenskapene til DDR oversett av mer tradisjonelle teknikker.
Central til bruk av levende celle bildebehandling er etableringen av fluorescensmerkede proteiner. Her beskriver vi bruken av en mCherry-tagget protein involvert i DDR, 53BP1, samt en histon H2B-GFP fusion produktet. Fluorescensmerkede proteiner er brukt mye i molekylær og cellebiologi, men de er ikke uten sine begrensninger. Feste en ny struktur for et endogent protein skaper åpenbare risikoen for å endre naturlige funksjon. Tillegg kan visse konstruerer og vil bli uttrykt ved forskjellige nivåer i ulike cellelinjer, under forskjellige betingelser. Vi har observert avvikende nivåer av fluorescerende intensitet i alle de genetisk manipulerte celler som brukes i denne undersøkelsen. Den 53BP1 konstruere brukt i denne protokollen mangler mest funksjonelle domener, men beholder den evnen til å binde til områder av DNA-skader som ikke synes å ha negativ innvirkning på cellen 2.
I tillegg er det viktig å vurdere metoden av gen produksjonstid. I denne protokollen, brukte vi to metoder: lentiviral transduksjon og stabil transfeksjon. Våre lentivirus-infiserte celler blir stabilt transduced med den fluorescerende konstruere;derfor vil de fortsette å uttrykke disse proteiner på ubestemt tid. Imidlertid er denne metoden noe mer arbeidskrevende sammenlignet transfeksjon og bestemmes av hvilken type av celler blir målrettet, noen celler er ikke mottagelig for effektiv transfeksjon. På den annen side, lentiviruses er stand til å angi de fleste celler, inkludert menneske. Etterforskerne oppfordres til å veie fordeler og ulemper til hver metode når det kommer til sine egne eksperimenter. Som et mulig middel for å omgå de problemer som ligger i fluorescensmerket merkede proteiner, ble bruken av celle-permeable fluorescensmerkede prober nylig rapportert for live celle eksperimenter 10. Imidlertid har denne teknikken ennå ikke fullt utviklet.
Den viktigste fordelen med levende celle bildebehandling er evnen til å studere Spatiotemporal relasjoner av DDR og DSB reparasjon. Faktisk var Dimitrova et al. (2008) i stand til å observere fluorescensmerkede levende celler og avslører romanen iformasjon om 53BP1 binding til telomerer og hvordan det påvirker kromatin dynamikk. Denne analysen vil være betydelig mer utfordrende, om ikke umulig, med andre metoder. Å ha muligheten til å overvåke DDR både i rom og tid tillater oss å skjelne funksjoner og relasjoner som vi kanskje ellers overse.
Oppsummert bruke levende celle bildebehandling gjør forskere å overvåke kinetikken DSB dannelse og oppløsning i sanntid, og tillater kvantitativ analyse på en enkelt celle-nivå. I tillegg til den teknikk som brukes i denne studien, kan andre anvendelser av levende celle avbildning benyttes, eksempel FRET og frap 3. Teknologien for å observere celler i sanntid vil fortsette å bli bedre på og brukes til å studere en rekke cellulære prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Støttes delvis av R01NS064593 og R21ES016636 (KV). Mikroskopi ble utført ved VCU - Institutt for nevrobiologi og anatomi Mikroskopi Facility, støttet, delvis med støtte fra NIH-NINDS senter kjerne stipend 5P30NS047463. Den roterende disk confocal mikroskop ble kjøpt med en NIH-NCRR award (1S10RR027957).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one | ||
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. | ||
| MEM media | GIBCO | ||
| Non-essential amino acids | GIBCO | ||
| Amino acids | GIBCO | ||
| Vitamins | GIBCO | ||
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene | ||
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene | ||
| SuperFect | Qiagen | ||
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss | ||
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss | ||
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss | ||
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
