A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å visualisere en DNA dobbel tråd pause signal protein aktiveres i respons til DNA-skade, så vel som dens lokalisering under mitose.

Abstract

Double-tråd pauser (DSBs) er den mest skadelige DNA lesjoner en celle kan støte på. Hvis venstre unrepaired, til DSBs havn stort potensial generere mutasjoner og kromosomabberasjoner ^en. For å forhindre dette traumer fra katalyserende genomisk ustabilitet, er det avgjørende for cellene å oppdage DSBs, aktivere DNA skade respons (DDR), og reparere DNA. Når stimulert, fungerer DDR å bevare genomisk integritet ved å utløse cellesyklus å tillate reparasjon å finne sted eller tvinge cellen til å gjennomgå apoptose. De dominerende mekanismer for DSB reparasjon skje gjennom ikkehomologe end-delta (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) (anmeldt i ^2). Det er mange proteiner hvis aktiviteter må være nøyaktig orkestrert for DDR å fungere skikkelig. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for 2 – og 3-dimensjonale (D) visualisering av en av disse proteinene, 53BP1.

P53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliserer til områder avDSBs ved binding til endrede histoner ^3,4, forming foci innen 5-15 minutter ^5. De histonmodifikasjonene og rekruttering av 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB områder antas å lette de strukturelle omleggingen av kromatin rundt områder av skade og bidra til DNA-reparasjon ^6. Utover direkte deltakelse i reparasjon, har flere roller er beskrevet for 53BP1 i DDR, som regulerer en intra-S sjekkpunkt, en G2 / M sjekkpunkt, og aktivere nedstrøms DDR proteiner ^7-9. Nylig ble det oppdaget at 53BP1 ikke danner foci i respons til DNA-skade indusert ved mitose, istedenfor å vente på celler å angi G1 før lokalisere til nærhet av DSBs ^6. DDR proteiner som 53BP1 har blitt funnet til å assosiere med mitotiske strukturer (for eksempel kinetochores) under progresjon gjennom mitose ^10.

I denne protokollen beskriver vi bruk av 2 – og 3-D live celle imaging å visualiseredannelsen av 53BP1 foci i respons til DNA-skade agenten camptothecin (CPT), samt 53BP1 oppførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I-inhibitor som primært forårsaker DSBs under DNA replikasjon. For å oppnå dette, brukte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusjonsprotein konstruere består av en 53BP1 protein domene stand til å binde DSBs ^11. I tillegg brukte vi en histone H2B-GFP fluorescerende fusjonsprotein konstruere stand til å overvåke kromatin dynamikk gjennom hele cellesyklus, men særlig under mitose ^12. Levende celle bildebehandling i flere dimensjoner er et utmerket verktøy for å utdype vår forståelse av funksjon av DDR proteiner i eukaryote celler.

Protocol

A. celleforberedelsen Normale primære fibroblaster (GM02270) ble hentet fra Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, og foreviget med hTERT 6. Cellene ble dyrket og utvidet i CellStar 6-cm retter i media (4 ml) som består av MEM supplert med 20% føtalt bovint serum (Gibco), non-essential/essential aminosyrer, vitaminer, natrium pyruvat, og penicillin / streptomycin (HyClone ). Humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket og utvidet i CellStar 6-cm retter. Cellene ble holdt i media (4 ml) bestående av DMEM supplert med 10% fetalt bovint serum, ikke-essensielle aminosyrer, L-glutamin, og penicillin / streptomycin. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro, Addgene plasmid 19836) og H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene plasmid 17735) fusion genet konstruerer også uttrykke puromycin eller G418 resistensgener, henholdsvis, ble omformet (fibroblam) eller transfekterte (HEK293) med SuperFect (Qiagene) inn i celler og vedlikeholdes i henhold til narkotika valg. Vedlikehold av fluorescens ble regelmessig kontrollert. 24-48 time før bildeopptak, ble cellene trypsinert i en enkelt-cellesuspensjon og sås med en lav tetthet på 3,5-cm FluroDish glass bunnplater. B. mikroskop Oppsett og Image Acquisition Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Zeiss Cell Observer SD spinne disk confocal mikroskop utstyrt med en AxioObserver Z1 stand, en dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 spinne disk enhet, 2 Fotometri QuantEM 512SC emCCD kameraer, en HXP 120C fiberbasert illuminator, 4 lasere (a Lasos 100mW flerlinjet Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diode, 40 mW 561 nm diode, og 30 mW 635 nm diode), AOTF, en Pecon XL multiS1 scenen inkubasjon system, Zeiss inkubering moduler (O 2 Modul S, CO 2 Modul S, TempModule S, Oppvarming Unit XL S) og en tidligere motorized XY scenen med en NanoScanZ piezo Z innsatsen. Å minimalisere sfæriske aberrasjoner mens bildebehandling levende celler støttet i et vandig medium, en C-Apochromat 63x/1.20 Vann / Corr objektivlinsen og Zeiss Immersol W nedsenking væske (med en brytningsindeks n = 1,334) ble anvendt. For 2 kanals confocal imaging, en RQFT 405/488/568/647 dichroic speil og BP525/50 (grønn) og BP629/62 (rød) utslipp filtre ble brukt. Systemprogramvaren som ble brukt var Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) med AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, fysiologi, MosaiX, Mark & ​​Finn, Dual Kamera, Inside 4D, Autofokus og 3-D dekonvolusjon moduler. Sørg for at CO 2 gass kjører til CO 2 Modul av inkuberingen systemet. Hvis mikroskop er støttet av en anti-vibrasjon luft tabellen, slår du på lufttilførselen (eller N 2 gass) for luft tabellen. Slå på strømmen for mikroskopstativet, spinning disk enhet, kameraer, inkubasjon moduler, HXP illuminator, motorisert stadium, Argonlaser, og datamaskinen. Etter 1 min av oppvarmingstid, vri om tenningsnøkkelen for Argon laser til "On". På Zeiss laser kontrollpanelet, slå på bryterne for laserlinjer skal brukes. Slå bryteren for Lasos Argon laser kontrolleren fra "standby" til "laser run" og juster lyset kontrolleren til det optimale nivået (dvs. like under det punktet hvor den grønne indikatoren blir rød). Start opp AxioVision programvare. Merk: brukergrensesnittet for AxioVision kan tilpasses med vinduer og pull-down menyer som er spesifikke for den enkelte mikroskop og komponenter som den kontrollerer. Som sådan, har hvert system en potensielt unike grensesnitt. Derfor er generelle instruksjoner for programvare manipulasjon gitt i etterfølgende trinn, snarere enn retninger for spesifikke programvare vinduer, faner og / eller trekk-ned menyer. Omtrent 1 time før bildebehandling, i programvaren, finner kontrollene for inkubator ogslå på varme for det øvre kammer og scenen plate. Still temperaturen til 37 ° C. Slå på CO 2 kontroll og sette nivået på 5%. Velg objektiv for bildebehandling. I denne studien ble det 63x/1.20 NA C-Apochromat Vann / Corr objektiv brukt Merk:. For dette objektivet, er en nedsenking medium med en brytningsindeks lik vann (Zeiss Immersol W nedsenking væske) nødvendig. Hvis flere separate posisjoner er som skal avsøkes over en lang periode, være sikker på å anvende en tilstrekkelig mengde av nedsenking middels å sikre at det føres fra en stilling til en annen. Sett formen på scenen og bringe objektivlinsen opp i kontakt med bunnen. Med enten mikroskop kontroller eller programvaren, dirigere lyset til okularene og velg riktig Widefield filter satt for fluorescerende signal av interesse (for denne studien, "Red" filter satt for 53BP1 og en "GFP" filter satt for H2B ). </ Li> Vis gjennom okulære linser, fokusere bildet, og finne en passende felt av celler. Bruk enten programvaren eller mikroskop kontroller, rette lyset bort fra okularene til porten med den confocal roterende plate enhet. I programvaren, slå på den aktuelle laseren (for denne studien, 561 nm laser for 53BP1 og 488 nm linjen i Argon laser for H2B). For hver kanal justere intensiteten av laser ved å justere den akusto-optic tunbare filter (AOTF) kontroll til et passende nivå. Velg riktig dichroic speil (RQFT 405/488/568/647) og utslipp filtre (BP 629/62 for 53BP1 og BP 525/50 for H2B). Åpne lukkeren til den roterende disken enheten. Velg "Live"-vinduet for å vise gjeldende synsfelt. I programvaren, åpne "Camera" kontroll, merker at kameraet skal brukes (hvis en to kamera system) og fastsette eksponeringen tid til ca 100 ms. Juster% og EM få så nec. unødig Merk: 53BP1-mCherry konstruere vises noe dim. Vi fant det nyttig å øke EM gevinst. I programvaren, åpner kontrollen for confocal roterende plate enhet og justere roterende plate hastighet ved å skrive inn kameraet eksponeringstid som ble satt til å ta et passende bilde (f.eks ~ 100 ms). Klikk på "Set" for å låse i endring. Åpne "multi-dimensjonale erverv". Velge kanal kategorien og laste / velg riktige kanaler. For denne studien bruker vi definerte kanaler for dsRed (561 nm laser eksitasjon og BP 629/62 filter for utslipp) og GFP (488 nm laser linje for eksitasjon og BP525/50 filter for utslipp). For å sikre image registrering, ble en felles dichroic speil (RQFT 405/488/568/647) som brukes for begge kanaler. Satt opp programvaren for "autofokus". Merk: Gå til Verktøy → Innstillinger editor for å justere MDA innstillinger. Sikre at tilstrekkelig laser makt er satt ("Tilstrekkelig laser makt" viser til en innstilling som gjør at duå opphisse den aktuelle fluoroforen samtidig minimere foto-bleking). I MDA-vinduet velger du z-stack kategorien. Velg "Z-stack på nåværende fokus posisjon". Angi området for ~ 10 mm z-stack og velg "optimal" for antall skritt for å sikre Nyquist sampling gjennom Z. Merk: Den eksakte størrelsen på z-stack vil avhenge av høyden på cellene dine. Justeres tilsvarende. 23. Klikk "Start" og analysere den resulterende z-stack bildet for å sikre at innstillingene er riktige for det du undersøker (f.eks i denne studien, var det viktig å avbilde hele kjernen). Velg "T" (tid)-kategorien. For vår eksperimentere med camptothecin, setter vi intervallet mellom tenkelig tidspunkter til 5 min og den totale varigheten av sesjon for 1 hr for en kontroll (ikke-behandlede celler) video Merk:. Å minimere foto-bleking av cellene, eksperimentet må konfigureres slik at AOTF tømmer laser mellom bildebehandling tidspunkter. Feller multi-point avbildning av flere celler i parabolen, i MDA-vinduet velger du posisjonen kategorien. Sikre "Apply"-innstillingen før / etter tidspunkt 'per stilling "er avmerket. Velg "Mark_Find". Bruke "Live", flytter fatet rundt og velge passende synsfelt. Klikk "Start" i multi-dimensjonale-oppkjøpet menyen for å starte forsøket og ta en kontroll video (av ubehandlede celler). Etter kontrollen videoen, legge den passende behandling (i dette tilfellet, 10 uM camptothecin). Vi spilte den eksperimentelle (narkotika-behandlede celler) video på 5-10 min intervaller for 2-4 timers. Merk: Et viktig spørsmål å vurdere er hvor raskt en gitt effekt oppstår etter behandling. Som sett i videoen, 53BP1 foci begynner å fra ~ 5 min etter tilsetning av CPT. Selv om en relativt enkel prosess, og legger stoffet til parabolen manuelt og re-kalibrering av mikroskop tar tid. Det må tas hensyn til dette ved utformingen eksperimenter. For overvåking mitosis, setter vi intervallet til 7,5 min, og registrert for 4-5 hr (de spesifikke innstillinger avhengig cellelinje som brukes og lengden av sin cellesyklus). Justeringer må gjøres for å forhindre bilde-bleking under lengre opptak. C. Bildebehandling og analyse Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av Volocity programvare (PerkinElmer). Programvaren som brukes til å skaffe disse dataene (AxioVision) har også muligheten til å behandle og analysere bilder. Brukere oppfordres til å utnytte programvaren tilgjengelig for dem, og konsultere rette litteratur om deres søknad. Åpne Volocity programvare. Opprette og navngi et nytt bibliotek, og importere videofiler. For å vise filene, vi vanligvis finner det mest nyttig å bruke "Utvidet Focus"-innstillingen. Dette legger på de z-stack skiver og for denne protokollen, tillater oss å visualisere 53BP1 foci i ulike områder av kjernen. Juster videoer som er nødvendig. Volocity er utstyrt med en rekke verktøy for å forbedre kvaliteten av ervervede bilder. Ved å sørge for innstillingene på mikroskopet var riktig, kan mye tid lagres i redigering senere. Ofte er det nyttig å deconvolve bildene, og justere lysstyrke / kontrast. Dine spesifikke redigering behov vil variere basert på forsøket. Legg til en relativ tidsangivelse og skala bar. Å vise celler i 3-D, bytte til "3-D Opacity"-innstillingen. Dette tillater rotasjon av 3-D gjengitt celler i verdensrommet, og dermed gi flere perspektiver av strukturer av interesse innenfor cellene. Merk: Det er nyttig å visualisere celler i forskjellige plan for å bestemme hvor strukturer av interesse for. For eksempel, i "Utvidet Focus" innstillingen er det vanskelig å skjelne at 53BP1 gjør, faktisk, dissosiere fra DNA under mitose. Dette er imidlertid åpenbar i 3-D. Filmer og stillbilder kan eksporteres til en rekke filtyper basert på brukerens preferanser. </l i> D. Representant Resultater Et eksempel på 53BP1 foci formasjonen i respons til CPT er vist i figur 1. Celler eksponert for CPT skjema foci innen 5-10 min, og opprettholde disse brennpunktene hele varigheten av opptaket. Som vist i figur 2, 53BP1 dissosierer fra kromatin ved utbruddet av mitose, danner en tynn dis rundt kondenserende kromosomer. Som Telofase oppstår og mitose kommer til en slutt, 53BP1 en gang aggregater inn i forskjellige fokus. Mens HEK293 cellene ikke ble utsatt for CPT, de likevel dannet rikelig, spontan 53BP1 reparasjon foci generert av endogen DNA skade. Denne observasjonen tillatt oss å konkludere med at 53BP1 ikke danner fokus under tidlig mitose, i tråd med en tidligere rapport som viser en lignende effekt etter eksponering av celler til ioniserende stråling og radiomimetic narkotika 5. ure en "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/> Figur 1. Camptothecin (10 mikrometer) fører DSBs og 53BP1 foci formasjon i sykling fibroblaster innen 30 min med å legge stoffet til mediet. Figur 2. 53BP1 ikke danner foci ved mitose inntil telophase/G1 i HEK293 celler.

Discussion

Vedlikehold av genomisk integritet er avgjørende for celle overlevelse. Unnlatelse av å bevare genom resultater i for tidlig aldring, kreft eller død ^8. Det er stor interesse i kresne hvordan DDR funksjoner, som stammer fra dens betydning for både grunnforskning og klinisk forskning. Mange teknikker har blitt utviklet gjennom årene for å hjelpe i studiet av hvordan celler oppdage og reparere DNA-skader. Tradisjonelle metoder som immunocytokjemi og vestlige blotting har vært bærebjelkene i feltet, men …

Materials

CellStar culture dishes	Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes	World Precision Instruments, Inc.
MEM media	GIBCO
Non-essential amino acids	GIBCO
Amino acids	GIBCO
Vitamins	GIBCO
Sodium Pyruvate	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;<br/> plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system	Zeiss
AxioVision (release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity software (version 6.0)	PerkinElmer