To-og tre-dimensjonale Live-Cell Imaging av DNA Damage Response Proteiner
Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å visualisere en DNA dobbel tråd pause signal protein aktiveres i respons til DNA-skade, så vel som dens lokalisering under mitose.
Abstract
Double-tråd pauser (DSBs) er den mest skadelige DNA lesjoner en celle kan støte på. Hvis venstre unrepaired, til DSBs havn stort potensial generere mutasjoner og kromosomabberasjoner en. For å forhindre dette traumer fra katalyserende genomisk ustabilitet, er det avgjørende for cellene å oppdage DSBs, aktivere DNA skade respons (DDR), og reparere DNA. Når stimulert, fungerer DDR å bevare genomisk integritet ved å utløse cellesyklus å tillate reparasjon å finne sted eller tvinge cellen til å gjennomgå apoptose. De dominerende mekanismer for DSB reparasjon skje gjennom ikkehomologe end-delta (NHEJ) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) (anmeldt i 2). Det er mange proteiner hvis aktiviteter må være nøyaktig orkestrert for DDR å fungere skikkelig. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for 2 – og 3-dimensjonale (D) visualisering av en av disse proteinene, 53BP1.
P53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliserer til områder avDSBs ved binding til endrede histoner 3,4, forming foci innen 5-15 minutter 5. De histonmodifikasjonene og rekruttering av 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB områder antas å lette de strukturelle omleggingen av kromatin rundt områder av skade og bidra til DNA-reparasjon 6. Utover direkte deltakelse i reparasjon, har flere roller er beskrevet for 53BP1 i DDR, som regulerer en intra-S sjekkpunkt, en G2 / M sjekkpunkt, og aktivere nedstrøms DDR proteiner 7-9. Nylig ble det oppdaget at 53BP1 ikke danner foci i respons til DNA-skade indusert ved mitose, istedenfor å vente på celler å angi G1 før lokalisere til nærhet av DSBs 6. DDR proteiner som 53BP1 har blitt funnet til å assosiere med mitotiske strukturer (for eksempel kinetochores) under progresjon gjennom mitose 10.
I denne protokollen beskriver vi bruk av 2 – og 3-D live celle imaging å visualiseredannelsen av 53BP1 foci i respons til DNA-skade agenten camptothecin (CPT), samt 53BP1 oppførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I-inhibitor som primært forårsaker DSBs under DNA replikasjon. For å oppnå dette, brukte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusjonsprotein konstruere består av en 53BP1 protein domene stand til å binde DSBs 11. I tillegg brukte vi en histone H2B-GFP fluorescerende fusjonsprotein konstruere stand til å overvåke kromatin dynamikk gjennom hele cellesyklus, men særlig under mitose 12. Levende celle bildebehandling i flere dimensjoner er et utmerket verktøy for å utdype vår forståelse av funksjon av DDR proteiner i eukaryote celler.
Protocol
Discussion
Vedlikehold av genomisk integritet er avgjørende for celle overlevelse. Unnlatelse av å bevare genom resultater i for tidlig aldring, kreft eller død 8. Det er stor interesse i kresne hvordan DDR funksjoner, som stammer fra dens betydning for både grunnforskning og klinisk forskning. Mange teknikker har blitt utviklet gjennom årene for å hjelpe i studiet av hvordan celler oppdage og reparere DNA-skader. Tradisjonelle metoder som immunocytokjemi og vestlige blotting har vært bærebjelkene i feltet, men …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttes delvis av R01NS064593 og R21ES016636 (KV). Mikroskopi ble utført ved VCU – Institutt for nevrobiologi og anatomi Mikroskopi Facility, støttet, delvis med støtte fra NIH-NINDS senter kjerne stipend 5P30NS047463. Den roterende disk confocal mikroskop ble kjøpt med en NIH-NCRR award (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
