Två-och tredimensionell levande cell imaging av svar DNA-skador Proteiner
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera en DNA-dubbel-strängbrott signalsystem protein aktiveras som svar på DNA-skada samt dess lokalisering vid mitos.
Abstract
Dubbelklicka strängbrott (DSB) är den mest skadliga DNA-skador en cell kan stöta på. Om den lämnas oreparerade till DSB hamn stor potential generera mutationer och kromosomavvikelser 1. För att förhindra detta trauma från katalysera genomisk instabilitet, är det viktigt för celler att upptäcka DSB, aktiverar svaret DNA-skada (DDR), och reparera DNA. När stimuleras arbetar DDR för att bevara genomisk integritet genom att utlösa cellcykelstopp för att möjliggöra reparation att äga rum eller tvinga cellen att genomgå apoptos. De dominerande mekanismerna för DSB reparation sker genom icke-homolog slutet gå (NHEJ) och homolog rekombination reparation (HRR) (granskas 2). Det finns många proteiner vars verksamhet måste noggrant iscensatt för DDR att fungera korrekt. Häri beskriver vi en metod för 2 – och 3-dimensionella (D) visualisering av ett av dessa proteiner, 53BP1.
P53-bindande protein 1 (53BP1) lokaliseras till områdenDSB genom att binda till modifierade histoner 3,4 och bildar foci inom 5-15 minuter 5. De histon modifieringar och rekrytering av 53BP1 och andra DDR proteiner till DSB sajter tros underlätta strukturella ombildning av kromatin runt områden av skador och bidra till DNA-reparation 6. Utöver direkta deltagande i reparation, har ytterligare roller beskrivits för 53BP1 i DDR, som reglerar en intra-S Checkpoint, en G2 / M Checkpoint, och aktivera nedströms DDR proteiner 7-9. Nyligen upptäcktes det att 53BP1 inte bildar foci som svar på DNA-skada inducerad under mitos, utan väntar på celler att gå in G1 innan lokalisera till närheten av DSB 6. DDR proteiner såsom 53BP1 har befunnits associera med mitotiska strukturer (såsom kinetochores) under framskridandet genom mitos 10.
I detta protokoll beskriver vi användningen av 2 – och 3-D-levande cell imaging att visualiserabildandet av 53BP1 härdar som svar på DNA-skadande medlet kamptotecin (CPT), liksom 53BP1 beteende under mitos. Kamptotecin är en topoisomeras I hämmare som främst orsakar DSB under DNA-replikation. För att uppnå detta har vi använt en tidigare beskrivna 53BP1-mCherry fluorescerande fusionsprotein bygga bestående av ett 53BP1 proteindomän kan binda DSB 11. Dessutom använde vi en histon H2B-GFP fluorescerande fusionsprotein konstruera kunna övervaka kromatin dynamik i hela cellcykeln, men i synnerhet under mitos 12. Levande cell imaging i flera dimensioner är ett utmärkt verktyg för att fördjupa vår förståelse av funktionen hos DDR proteiner i eukaryota celler.
Protocol
Discussion
Underhåll av genomisk integritet är avgörande för cellens överlevnad. Underlåtenhet att bevara genomet resulterar i för tidigt åldrande, cancer eller död 8. Det är intensivt intresse för kräsna hur DDR funktioner, som härrör från dess betydelse för både grundforskning och klinisk forskning. Många tekniker har utvecklats under åren för att hjälpa till vid studiet av hur celler upptäcka och reparera DNA-skador. Traditionella metoder som immuncytokemi och Western blotting har varit hörnste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöds delvis av R01NS064593 och R21ES016636 (KV). Mikroskopi utfördes vid OAV – Institutionen för neurobiologi & anatomi Mikroskopi Facility, som stöds delvis med finansiering från NIH-NINDS Center kärna bidrag 5P30NS047463. Den roterande skiva konfokalmikroskop köptes med en NIH-NCRR utmärkelse (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
