تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت
Summary
تبادل المنافع والمصالح لدراسة بين<em> Xenorhabdus</em> البكتيريا و<em> Steinernema</emوقد وضعت> الديدان الخيطية، وأساليب لرصد وجود البكتيريا والديدان الخيطية موقع داخل. المنهج التجريبي، والتي يمكن تطبيقها على النظم الأخرى، ينطوي على البكتيريا الهندسة للتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء وتصور، وذلك باستخدام البكتيريا المجهري مضان داخل الديدان الخيطية شفافة.
Abstract
Symbioses، والذين يعيشون معا من اثنين أو أكثر من الكائنات الحية، على نطاق واسع في جميع ممالك الحياة. عن اثنين من أكثر الكائنات في كل مكان على وجه الأرض، والديدان الخيطية البكتيريا تشكل مجموعة واسعة من الجمعيات التكافلية التي تتراوح من المفيد الممرضة 1-3. واحد هذه الجمعيات هي العلاقة متبادل المنفعة بين البكتيريا والديدان الخيطية Xenorhabdus Steinernema، التي برزت بوصفها نظاما من طراز التعايش 4. النيماتودا الممرضة للحشرات هي Steinernema، وذلك باستخدام المتكافل البكتيرية بهم لقتل الحشرات 5. لنقل بين المضيفين الحشرات، والبكتيريا استعمار الامعاء من الديدان الخيطية في المرحلة المعدية الأحداث 6-8. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت عدة أنواع النيماتودا الأخرى للاستفادة من البكتيريا لقتل الحشرات 9-13، والتحقيقات بدأت دراسة التفاعلات بين النيماتودا والبكتريا في هذه النظم <سوب> 9.
وصفنا طريقة لرؤية المتكافل البكتيرية داخل أو على مضيف الديدان الخيطية، والاستفادة من الشفافية البصرية من الديدان الخيطية عند عرضها بواسطة المجهر. صممت هذه البكتيريا في التعبير عن بروتين فلوري، مما يسمح التصور من خلال الفحص المجهري مضان. وتتوفر العديد من البلازميدات التي تحمل الجينات ترميز البروتينات التي يتألق عند أطوال موجية مختلفة (أي أخضر أو أحمر)، والاقتران من البلازميدات من الإشريكية القولونية سلالة المانحة إلى المتلقية المتكافل البكتيرية ناجحة لمجموعة واسعة من البكتيريا. تم تطوير الأساليب المذكورة للتحقيق في العلاقة بين carpocapsae Steinernema وXenorhabdus nematophila 14. وقد استخدمت أساليب مماثلة للتحقيق في غيرها من الديدان الخيطية-بكتيريا الجمعيات 9، 15-18، وفي النهج وبالتالي ينطبق عموما.
والتقىهود يسمح توصيف جود البكتيريا والديدان الخيطية التوطين داخل في مراحل مختلفة من التنمية، وتوفير نظرة ثاقبة لطبيعة تكوين الجمعيات وعملية الاستعمار 14 و 16 و 19. التحليل المجهري يكشف كل من تواتر الاستعمار بين السكان وتوطين البكتيريا لاستضافة الأنسجة 14، 16، 19-21. هذا هو ميزة على غيرها من أساليب رصد البكتيريا داخل السكان الديدان الخيطية، مثل صوتنة 22 أو طحن 23، التي يمكن أن توفر مستويات متوسط الاستعمار، ولكن قد لا، على سبيل المثال، تميز السكان مع ارتفاع وتيرة منخفضة الأحمال المتكافل من السكان مع تردد انخفاض الأحمال المتكافل عالية. يمكن تمييز وتيرة وحمولة من البكتيريا استعمار أهمية خاصة عند فحص الجرثومي أو وصف المسوخ للاستعمار الظواهر 21، 24. في الواقع، وقد استخدم المجهر مضان في فحص إنتاجية عالية من المسوخ البكتيرية لعيوب في الاستعمار 17 و 18، وأقل شاقة من الأساليب الأخرى، بما في ذلك صوتنة 22، 25-27 و الفردية تشريح الديدان الخيطية 28 و 29.
Protocol
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة للكشف البصري من البكتيريا داخل مجموعة الديدان الخيطية (الشكل 1). هذه الطريقة يستفيد من الشفافية البصرية من الديدان الخيطية والقدرة على تسمية fluorescently البكتيريا، مما يتيح تحليل في الجسم الحي من البكتيريا داخل المضيف الدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر أوجينيو فيفاس، Heungens كورت، مارتنز اريك، كولز تشارلز، سكر داربي، Stabb اريك، وتود Ciche لما قدموه من مساهمات في تطوير هذا البروتوكول والأدوات المستخدمة. وقدم الدعم KEM وJMC من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الجائزة الوطنية خدمة أبحاث T32 (AI55397 "الميكروبات في الصحة والمرض"). وأيد من قبل JMC مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) زمالة دراسات عليا أبحاث. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-0920631 0950873 وIOS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
- Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
- Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity – hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
- Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
- Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
- Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
- Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
- Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
- Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
- Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
- Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
- Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
- Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
- Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
- Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
- Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
- Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
- Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
- Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
- Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
- Ciche, T. A., Goffredi, S. K., Reddy, C. A. . Methods in General and Molecular Microbiology. , 394-419 (2007).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A., Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. . Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. , 239-269 (2009).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. . Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 375-425 (2012).
- Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
- Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
- White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
- Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
- Sicard, M., Brun, N. L. e. Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
- Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
- Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
- Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
- Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , (1988).
