Summary

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

Published: October 19, 2012
doi:

Summary

כדי ללמוד את ההדדיות בין<em> Xenorhabdus</em> חיידקים<em> Steinernema</em> נמטודות, שיטות פותחו כדי לפקח על נוכחות ומיקום בתוך נמטודות חיידקים. הגישה הניסויית, אשר יכול להיות מיושמת על מערכות אחרות, כרוכה בחיידקי הנדסה לבטא חלבון פלואורסצנטי הירוק והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חיידקים בתוך נמטודות השקופה.

Abstract

Symbioses, החיים משותפים של שניים או יותר אורגניזמים, הם נפוצים לאורך כל ממלכות חיים. כשתיים מכל מקום אורגניזמים ביותר על פני אדמה, נמטודות וחיידקים יוצרים מגוון רחב של עמותות סימביוטיים שנע בין מועיל לפתוגניים 1-3. עמותה אחת כזו היא מערכת היחסים הדדיים המועילה בין חיידקי Xenorhabdus ונמטודות Steinernema, שהתפתחה כמערכת מודל של סימביוזה 4. נמטודות Steinernema היא entomopathogenic, באמצעות חיידקי סימביונט להרוג חרקים 5. להעברה בין מארחי חרקים, החיידקים להתנחל המעי של שלב נעורי התולעת של נמטודות 6-8. לאחרונה, כמה מינים נמטודות אחרים הוכחו לנצל חיידקים להדברת חרקים 9-13, וחקירות שהחלו לבחון את יחסי הגומלין בין נמטודות והחיידקים במערכות אלה <sup> 9.

אנו מתארים שיטה להדמיה של סימביונט חיידקים בתוך או על מארח נמטודות, מנצלים את השקיפות האופטית של נמטודות כאשר נצפו על ידי מיקרוסקופ. את החיידקים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי, המאפשר ההדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלסמידים רבים זמינים שנושאים גני מקודדי חלבונים כי לזרוח באורכי גל שונים (כלומר ירוק או אדום), וצמיד של פלסמידים מזן חיידקי Escherichia תורם לסימביונט חיידקי נמען היא מוצלחת למגוון רחב של חיידקים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לחקור את הקשר בין Steinernema carpocapsae וXenorhabdus nematophila 14. שיטות דומות שמשו כדי לחקור עמותות אחרות נמטודות-חיידק 9, 15-18 והגישה לכן היא באופן כללי.

נפגשהוד מאפשר אפיון של נוכחות ולוקליזציה חיידקים בתוך נמטודות בשלבים שונים של פיתוח, לספק תובנה על טבעה של העמותה והתהליך של קולוניזציה 14, 16, 19. ניתוח מיקרוסקופי מגלה שכיחות הקולוניזציה בתוך אוכלוסייה ולוקליזציה של חיידקים לארח רקמות 14, 16, 19-21. זה יתרון על פני שיטות אחרות לניטור חיידקים בתוך אוכלוסיות נמטודות, כגון sonication 22 או טחינת 23, אשר יכול לספק רמות ממוצעות של התישבות, אבל לא יכול, למשל, להפלות אוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של עומסי סימביונט נמוכים מאוכלוסיות עם תדירות נמוכה של עומסי סימביונט גבוהים. להפלות את התדירות והעומס של חיידקים מיישבים יכול להיות חשוב במיוחד כאשר הקרנה או אפיון מוטציות חיידקים לפנוטיפים קולוניזציה 21, 24. אכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות חיידקים לפגמים ב17 קולוניזציה, 18, ​​והוא פחות מייגע מאשר שיטות אחרות, כולל sonication 22, 25-27 ונתיחת פרט נמטודות 28, 29.

Protocol

1. בנייה של זן חיידקי פלורסנט באמצעות צימוד לגדול מתח הנמען (סימביונט להיבחן) ומתח תורם בן לילה. המתח התורם, בדרך כלל חיידקי Escherichia, צריך להיות מסוגל לתרום דנ"א באמצעות נטייה ויש לשנותה עם פלסמיד (טבלה 2) ?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי האופטי של חיידקים בתוך מארח נמטודות (איור 1). שיטה זו מנצלת את השקיפות האופטית של נמטודות ויכולת fluorescently חיידקי תווית, מה שמאפשר בניתוח vivo של חיידקים בתוך פונדקאי נמטודות (איור 3). באופן ספציפי, גישה זו מזהה ל?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לאוג'ניו Vivas, הקורט Heungens, אריק מרטינס, צ'ארלס קאולס, דארבי סוכר, אריק Stabb, וטוד Ciche על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה וכלים בשימוש. KEM וJMC נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) בפרס לאומי לחקר שרותים T32 (AI55397 "חיידקי מחלה ובריאות"). המרכז למוסיקת ירושלים נתמך על ידי מלגת מחקר למוסמכי קרן לאומית למדע (NSF). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומי למדע (IOS-0920631 וIOS-0950873).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Lipid Agar
(sterile)
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)
7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)
8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM

References

  1. Holterman, M., van der Wurff, A. Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades. Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).
  2. Lambshead, P. J. D., Boucher, G. Marine nematode deep-sea biodiversity – hyperdiverse or hype. J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).
  3. Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitol. 56, 385-390 (1966).
  4. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
  5. Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).
  6. Bird, A. F., Akhurst, R. J. The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae. Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).
  7. Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation. Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).
  8. Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).
  9. Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia. Virulence. 2, 158-161 (2011).
  10. Abebe, E., Jumba, M. An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae. J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).
  11. Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis. Biol. Control. 59, 123-129 (2011).
  12. Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost. Nematology. 12, 121-135 (2010).
  13. Zhang, C., Liu, J. Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).
  14. Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).
  15. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  16. Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).
  17. Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens. BMC Microbiol. 10, 45 (2010).
  18. Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis. Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).
  19. Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization. Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).
  20. Sugar, D. R., Murfin, K. E. Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes. Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).
  21. Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).
  22. Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).
  23. Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila. J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).
  24. Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism. J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).
  25. Ciche, T. A., Goffredi, S. K., Reddy, C. A. . Methods in General and Molecular Microbiology. , 394-419 (2007).
  26. Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A., Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. . Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques. , 239-269 (2009).
  27. Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. . Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 375-425 (2012).
  28. Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes. J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).
  29. Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes. J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).
  30. White, G. F. A method for obtaining infective nematode larvae from cultures. Science. 66, 302-303 (1927).
  31. Ciche, T. A., Ensign, J. C. For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).
  32. Sicard, M., Brun, N. L. e. Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction. Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).
  33. Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).
  34. Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors. Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).
  35. Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).
  36. Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria. Gene. 109, 167-168 (1991).
  37. Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. Southern Cooperative Series Bulletin 331. , (1988).

Play Video

Cite This Article
Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).

View Video