Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

Summary

כדי ללמוד את ההדדיות בין<em> Xenorhabdus</em> חיידקים<em> Steinernema</em> נמטודות, שיטות פותחו כדי לפקח על נוכחות ומיקום בתוך נמטודות חיידקים. הגישה הניסויית, אשר יכול להיות מיושמת על מערכות אחרות, כרוכה בחיידקי הנדסה לבטא חלבון פלואורסצנטי הירוק והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חיידקים בתוך נמטודות השקופה.

Abstract

Symbioses, החיים משותפים של שניים או יותר אורגניזמים, הם נפוצים לאורך כל ממלכות חיים. כשתיים מכל מקום אורגניזמים ביותר על פני אדמה, נמטודות וחיידקים יוצרים מגוון רחב של עמותות סימביוטיים שנע בין מועיל לפתוגניים ^1-3. עמותה אחת כזו היא מערכת היחסים הדדיים המועילה בין חיידקי Xenorhabdus ונמטודות Steinernema, שהתפתחה כמערכת מודל של סימביוזה ^4. נמטודות Steinernema היא entomopathogenic, באמצעות חיידקי סימביונט להרוג חרקים ^5. להעברה בין מארחי חרקים, החיידקים להתנחל המעי של שלב נעורי התולעת של נמטודות ^6-8. לאחרונה, כמה מינים נמטודות אחרים הוכחו לנצל חיידקים להדברת חרקים ^9-13, וחקירות שהחלו לבחון את יחסי הגומלין בין נמטודות והחיידקים במערכות אלה <sup> 9.

אנו מתארים שיטה להדמיה של סימביונט חיידקים בתוך או על מארח נמטודות, מנצלים את השקיפות האופטית של נמטודות כאשר נצפו על ידי מיקרוסקופ. את החיידקים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי, המאפשר ההדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלסמידים רבים זמינים שנושאים גני מקודדי חלבונים כי לזרוח באורכי גל שונים (כלומר ירוק או אדום), וצמיד של פלסמידים מזן חיידקי Escherichia תורם לסימביונט חיידקי נמען היא מוצלחת למגוון רחב של חיידקים. בשיטות המתוארות פותחו כדי לחקור את הקשר בין Steinernema carpocapsae וXenorhabdus nematophila ^14. שיטות דומות שמשו כדי לחקור עמותות אחרות נמטודות-חיידק ^{9, 15-18} והגישה לכן היא באופן כללי.

נפגשהוד מאפשר אפיון של נוכחות ולוקליזציה חיידקים בתוך נמטודות בשלבים שונים של פיתוח, לספק תובנה על טבעה של העמותה והתהליך של קולוניזציה ^{14, 16, 19.} ניתוח מיקרוסקופי מגלה שכיחות הקולוניזציה בתוך אוכלוסייה ולוקליזציה של חיידקים לארח רקמות ^{14, 16, 19-21.} זה יתרון על פני שיטות אחרות לניטור חיידקים בתוך אוכלוסיות נמטודות, כגון sonication ²² או טחינת ^23, אשר יכול לספק רמות ממוצעות של התישבות, אבל לא יכול, למשל, להפלות אוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של עומסי סימביונט נמוכים מאוכלוסיות עם תדירות נמוכה של עומסי סימביונט גבוהים. להפלות את התדירות והעומס של חיידקים מיישבים יכול להיות חשוב במיוחד כאשר הקרנה או אפיון מוטציות חיידקים לפנוטיפים קולוניזציה ^{21, 24.} אכן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש בהקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות חיידקים לפגמים ^{ב17 קולוניזציה, 18,} ​​והוא פחות מייגע מאשר שיטות אחרות, כולל sonication ^{22, 25-27} ונתיחת פרט נמטודות ^{28, 29.}

Protocol

1. בנייה של זן חיידקי פלורסנט באמצעות צימוד לגדול מתח הנמען (סימביונט להיבחן) ומתח תורם בן לילה. המתח התורם, בדרך כלל חיידקי Escherichia, צריך להיות מסוגל לתרום דנ"א באמצעות נטייה ויש לשנותה עם פלסמיד (טבלה 2) ?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי האופטי של חיידקים בתוך מארח נמטודות (איור 1). שיטה זו מנצלת את השקיפות האופטית של נמטודות ויכולת fluorescently חיידקי תווית, מה שמאפשר בניתוח vivo של חיידקים בתוך פונדקאי נמטודות (איור 3). באופן ספציפי, גישה זו מזהה ל?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM