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Biology

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग नेमाटोड में जीवाणु Visualizing

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4298
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison

Summary

बीच पारस्परिक अध्ययन

Protocol

1. संयुग्मन के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट बैक्टीरियल तनाव का निर्माण

  1. प्राप्तकर्ता (symbiont लिए जांच की जा) तनाव और दाता तनाव रातोंरात आगे बढ़ें. दाता तनाव, आमतौर पर Escherichia कोलाई, विकार के माध्यम से डीएनए दान करने में सक्षम हो सकता है और साथ बदल किया जाना चाहिए (2 तालिका) प्लाज्मिड कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन एन्कोडिंग किया जाता है. प्लाज्मिड पर निर्भर करता है, एक विकार सहायक तनाव भी आवश्यक हो सकता है. यदि हां, तो इस तनाव भी रातोंरात बड़े हो जाना चाहिए. दाता तनाव और सहायक तनाव एंटीबायोटिक दवाओं के साथ हो प्लाज्मिड के रखरखाव के लिए चयन किया जाना चाहिए.
  2. पोषक तत्व अमीर विकास संस्कृति का एक 1:100 मध्यम अनुपात में एंटीबायोटिक दवाओं की कमी मीडिया में दाता, सहायक, और प्राप्तकर्ता उपभेदों subculture.
  3. प्रत्येक तनाव के लिए उपयुक्त तापमान पर संस्कृतियों बढ़ने जब ​​तक वे मध्य लॉग चरण विकास (600 आयुध डिपो 0.6 ~) तक पहुँचने. Xenorhabdus और ई. के लिए विकसित करने के लिए इस स्तर कोलाईवें subculturing के बाद लगभग 3 से 4 घंटे तक पहुँच जाता है. इस तनाव के आधार पर भिन्न हो सकता है, या कुछ मामलों में प्लाज्मिड इस्तेमाल किया,.
  4. एक microcentrifuge ट्यूब और 17,900 XG (ज्यादातर microfuges में 13,000 rpm) में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में उपभेदों मिलाएं. दाता और प्राप्तकर्ता है कि सबसे अच्छा परिणाम पैदावार के अनुपात विभिन्न संयोजनों के लिए अलग अलग, और empirically निर्धारित किया जा सकता है. एक Xenorhabdus प्राप्तकर्ता और ई. के लिए कोलाई दाता, हम एक 3:1 या 1:1 के अनुपात का उपयोग करें. यदि एक सहायक तनाव (जैसे ई. कोलाई) की जरूरत है, यह दाता के रूप में एक ही अनुपात में जोड़ा जाना चाहिए.
  5. तैरनेवाला छानना.
  6. ताजा मीडिया के 30 μl में सेल गोली को स्थगित कर देते हैं.
  7. किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एक पोषक तत्व अमीर मीडिया थाली पर निलंबन स्पॉट, और हाजिर शुष्क करने की अनुमति.
  8. थाली, औंधा, रातोंरात एक प्राप्तकर्ता जीवाणु और दाता के लिए अनुमति (और सहायक, यदि लागू हो) के लिए अधिकतम तापमान पर सेते हैं. थाली चाहिएकम से कम 18 घंटा incubated.
  9. नखरेखा और एक चयनात्मक एंटीबायोटिक प्लेट पर एकल कालोनियों के लिए हाजिर लकीर. एंटीबायोटिक दवाओं दाता के खिलाफ और प्लाज्मिड युक्त प्राप्तकर्ता के लिए चयन करना चाहिए. एक या दो अतिरिक्त अलगाव धारियाँ एक शुद्ध संस्कृति को अलग करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  10. जिसके परिणामस्वरूप कालोनियों प्राप्तकर्ता symbiont नहीं दाता तनाव प्राप्तकर्ता कॉलोनी, आकारिकी, या पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्राप्तकर्ता विशेष जीन के पता लगाने के रूप में विशिष्ट phenotypes, की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग कर रहे हैं सुनिश्चित करें. एक ज्ञात प्लाज्मिड अनुक्रम और प्रतिदीप्ति पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा प्लाज्मिड की उपस्थिति के लिए कालोनियों स्क्रीन. कालोनियों सही फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इसी तरंगदैर्ध्य के तहत प्रतिदीप्ति चाहिए.

2. Axenic निमेटोड अंडे का उत्पादन

  1. प्राकृतिक बैक्टीरियल symbiont के 5 मिलीलीटर रातोंरात आगे बढ़ें. एक संस्कृति शुरू करने के लिए, बैक्टीरिया Lysogeny (पौंड) शोरबा या अन्य घन में inoculated किया जा सकता हैएक फ्रीजर स्टॉक से सीधे या एक लकीर प्लेट से LTURE मीडिया.
  2. जीवाणु संस्कृति की 600 μl 10 मिमी लिपिड अग्रवाल (ला) 29 प्लेटों पर बिखरा हुआ है. आठ से दस प्लेटें अधिकांश प्रजातियों के लिए पर्याप्त नेमाटोड निकलेगा.
  3. दो दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस में नमी के बिना अंधेरे में सेते हैं.
  4. बैक्टीरिया के लॉन में 5000 संक्रामक नेमाटोड किशोर, या मीडिया के 500 μl में इस्तेमाल किया जा रहा है निमेटोड पर निर्भर करता है, दूसरे चरण जोड़ें. 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
  5. वयस्क नेमाटोड और अंडे की उपस्थिति के लिए अपनी प्लेट की जाँच करें. एक खुर्दबीन स्लाइड पर पानी की 20 μl रखें. परिमार्जन अप नेमाटोड की एक छोटी राशि बैक्टीरियल लॉन से एक बाँझ छड़ी का प्रयोग. पानी में छड़ी प्लेस और नेमाटोड से तैरने के लिए अनुमति देते हैं. कम वृद्धि के तहत अपनी स्लाइड को देखो. उपस्थिति के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा और चित्रा 2.
  6. यदि अंडे और महिलाओं के दिखाई दे रहे हैं, जारी रखें, अन्यथा, 25 और घ प्लेटों सेते हैंजैसे, सी और समुचित विकास के हर 6-12 घंटे के लिए जाँच करें. जब महिलाओं के अंडे होते हैं, प्लेटों की सतह पर पानी की कुछ मिलीलीटर जगह है. धीरे प्लेटें घुमाना और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पानी डालना. नेमाटोड प्लेटों के आते हैं और अब थाली सतह पर दिखाई जानी चाहिए. कई rinses आवश्यक हो सकता है.
  7. नेमाटोड ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
  8. नेमाटोड कुल्ला. ट्यूब के ऊपर से अतिरिक्त पानी विंदुक. साफ पानी और वयस्क नेमाटोड व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के साथ फिर से भरना. अतिरिक्त पानी विंदुक.
  9. अंडे समाधान के साथ शंक्वाकार ट्यूब भरें. एक बार अंडा समाधान जोड़ा है अंडे समाधान के साथ सभी चरणों के समय बिल्कुल के रूप में वर्णित अधिकतम अंडे की उपज के लिए आगे बढ़ना चाहिए. ट्यूबों सेते हैं जबकि धीरे ठीक 10 मिनट के लिए मिलाते. अधिकांश नेमाटोड ऊष्मायन के अंत तक भंग किया जाना चाहिए.
  10. तुरंत ठीक 10 मिनट के लिए 1250 XG शंक्वाकार ट्यूब (इस अपकेंद्रित्र लाने के लिए गति अपकेंद्रित्रलेकिन नीचे 0 x छ नहीं है. ब्रेक का उपयोग करें).
  11. तुरंत तैरनेवाला छानना.
  12. अंडा समाधान के साथ तुरंत pipetting द्वारा गोली फिर से स्थगित कर देते हैं.
  13. तुरंत अंडे समाधान के साथ शंक्वाकार ट्यूब भरने के लिए और inverting 3-5 बार द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से. तो तुरंत 2.10 के रूप में स्पिन.
  14. तुरंत तैरनेवाला छानना.
  15. लेग में pipetting द्वारा गोली पुनः स्थगित करता है, सुधार Pelleting के लिए धोने के चरणों के दौरान एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब हस्तांतरण. लेग Steinernema एसपीपी के लिए मानक है. अन्य buffers (उदाहरण के लिए एक न्यूनतम लवण मध्यम) निमेटोड और जीवाणु पर निर्भर करता है, को ध्यान में रखते हुए बफर या तो निमेटोड या जीवाणु को नुकसान नहीं होना चाहिए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  16. और 2.10 के रूप में लेग स्पिन के साथ ट्यूब भरें.
  17. तैरनेवाला छानना, और पौंड में फिर से को निलंबित.
  18. नेमाटोड 2.14 और 2.15 दोहरा द्वारा 3 बार के एक कुल कुल्ला.
  19. एक उचित मात्रा फिर से निलंबित निमेटोड अंडे पतला. Microliter प्रति कम से कम 10 अंडे होना चाहिए. उदाहरण केजी एस कम से कम चार दिनों के लिए एक 6 सेमी 5 मिलीलीटर लेग में पेट्री डिश में एंटीबायोटिक है कि बस्तियां बैक्टीरिया की वृद्धि को बाधित जोड़ने और parafilm में थाली लपेटकर द्वारा संग्रहित किया जा सकता है. अंडे 15 मिलीलीटर पौंड (2.13 और 2.14 में) में एक बार पहले बैक्टीरियल लॉन पर inoculating धोया जा आवश्यकता होगी. ध्यान दें कि इस समय के दौरान अंडे हैच और सिंक्रनाइज़ नहीं हो सकता developmentally जब उपनिवेश की स्थापना assays में इस्तेमाल किया जाएगा.

3. फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के साथ सह खेती परख

  1. फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया रातोंरात बढ़ने, यदि आवश्यक प्लाज्मिड के लिए चयन.
  2. 10 मिमी लिपिड अग्रवाल प्लेटों पर एक बाँझ छड़ी के साथ जीवाणु संस्कृति की 600 μl बिखरा हुआ है. 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. प्रत्येक लिपिड अगर प्लेट पर 100 से 400 μl (200 μl में बेहतर 2,000 नेमाटोड) के एक कुल में 500-5,000 axenic निमेटोड अंडे रखें.
  4. 25 में नमी के बिना अंधेरे में सेते ° सी आई जे एस, या ब्याज, फार्म के दूसरे चरण तक. आई जे एस एक फू के रूप में दिखाई देता हो जाएगाथाली के किनारे पर ZZY सफेद अंगूठी. अन्य जीवन चरणों को देखने के लिए, प्रोटोकॉल 4.
  5. एक संशोधित व्हाइट 30 जाल में प्लेटें प्लेस. लिपिड अगर प्लेट के ढक्कन निकालें और एक खाली 100 x 20 मिमी पेट्री डिश मिमी के नीचे में नीचे जगह. पानी के साथ बड़ी पेट्री डिश, या अन्य अपने निमेटोड के लिए उपयुक्त बफर भरें, छोटी प्लेट के चारों ओर. जल स्तर लगभग आधा छोटी प्लेट की ऊंचाई होना चाहिए.
  6. पानी के जाल सेते तक संतान आई जे एस बफर में उभरा है.
  7. संक्रामक किशोर नेमाटोड एक टिशू कल्चर फ्लास्क में पानी में संग्रहित किया जा सकता है.

4. स्क्रीनिंग के लिए प्रारंभिक जीवन चरणों का संग्रह

  1. उपयोग 3.1 3.4 के माध्यम से परख को स्थापित करने के लिए कदम है.
  2. प्लेटें सेते हैं जब तक वांछित जीवन चरणों मौजूद हैं. दैनिक दृश्य निरीक्षण के लिए समय निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए, 2.5 प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करें. एस के लिए carpocapsae एक्स के साथ eggsgrown ला प्लेटों पर nematophila, गर्भवती महिलाओं में 4-5 दिन में मौजूद होगा, किशोरों 7 दिनों में मौजूद हो सकता है, और संक्रामक किशोरों के लिए 15-17 दिनों से उत्पादन शुरू कर देंगे.
  3. जब वांछित जीवन चरणों मौजूद हैं, अपने नमूने इकट्ठा. पीबीएस की में 200 μl या अन्य उपयुक्त बफर के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से भरें. धीरे से बैक्टीरियल लॉन कि नेमाटोड के कुछ कुरेदना. एक मटर के आकार के (~ 50 मिलीग्राम) राशि कम से कम कई सौ नेमाटोड प्रदान बार F1 संतान का उत्पादन कर रहे हैं, तो होगा, लेकिन पहले समय अंक के लिए आवश्यक हो सकता है. स्टिक को अच्छी तरह से युक्त बफर में रखें.
  4. 30 सेकंड के लिए एक मिनट के लिए सेते हैं. छड़ी निकालें और बंद शेष अवशेषों परिमार्जन. छड़ी का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से किसी भी अगर हटाने. नेमाटोड बफर भीतर दिखाई जानी चाहिए. एक साफ microfuge ट्यूब बफर मिश्रण हटो.
  5. Levamisole या अन्य paralyzing एजेंट के साथ नेमाटोड समझो. 30 और म्यू में levamisole की कुछ अनाज भंगपानी के एल. नमूने के प्रत्येक 50 μl के लिए इस मिश्रण की 1-2 μl जोड़ें. Levamisole उपचार के बाद नेमाटोड अलाभकारी हो जाएगा.
  6. यदि नमूने एक बाद की तारीख में देखा जाएगा, ठीक है, इस कदम के रूप में वर्णित है. यदि नहीं, तो 4.6 कदम को छोड़. लगानेवाला 1X बफर और 4% paraformaldehyde युक्त समाधान के 200 μl जोड़ें. धीरे मिक्स, pipetting नाजुक जीवन चरणों lyse करने के लिए कारण हो सकता है. पन्नी के साथ कवर, और कम से कम 18 घंटे के लिए कम पर एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. एक ट्यूब रैक में ट्यूब प्लेस, और नेमाटोड ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  8. नेमाटोड कुल्ला पृष्ठभूमि निकालें. अतिरिक्त तरल विंदुक और 200 जोड़ने के बफर के 500 μl और धीरे मिश्रण. दोहराएँ. यह एक बार कुछ अधिक पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए अगर वांछित दोहराया जा सकता है.
  9. नेमाटोड ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें और वांछित मात्रा में फिर से को निलंबित.
  10. यदि नेमाटोड तय नहीं कर रहे हैं, तुरंत स्क्रीन. फिक्स्ड नेमाटोड लिए रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता हैदो सप्ताह के लिए. स्टोर अंधेरे में.

5. माइक्रोस्कोपी द्वारा बैक्टीरियल एसोसिएशन के लिए स्क्रीनिंग नेमाटोड

  1. अपने मिश्रण का एक छोटा सा नमूना हटाने के द्वारा खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए कुछ नेमाटोड का चयन करें.
  2. यह सुनिश्चित करने है कि नेमाटोड तस्वीर के लिए अभी भी कर रहे हैं, एक झोले के मारे हुए एजेंट के रूप में 4.5 प्रोटोकॉल में वर्णित के साथ इलाज. यदि आप एक तस्वीर नहीं ले जा रहे हैं या नेमाटोड पहले से ही तय कर रहे हैं, इस कदम को छोड़ दिया जा सकता है.
  3. अपने खुर्दबीन स्लाइड के लिए पानी में सूत्रकृमि का 20-30 μl जोड़ें और शीर्ष पर एक coverslip जगह.
  4. पूरे प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें नेमाटोड देखने के क्षेत्र में कर रहे हैं नेमाटोड देखें.
  5. खुर्दबीन कि बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त प्रतिदीप्ति से मेल खाती है पर फ्लोरोसेंट सेटिंग का उपयोग नेमाटोड देखें.
  6. बैक्टीरियल स्थानीयकरण की पहचान करने के लिए, फ्लोरोसेंट सेटिंग और एक प्रकाश माइक्रोस्कोपी सेटिंग के तहत निमेटोड की तस्वीरें लेने के लिए, और फिर छवियों का मिलाना. तस्वीरों के लिए एक ही महसूस करने की आवश्यकता हैदेखने के घ. Magnifications और देखा गया निमेटोड की कोशिश करने के लिए बैक्टीरिया को खोजने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  7. निमेटोड औपनिवेशीकरण के वितरण नेमाटोड की एक आबादी की गिनती, बैक्टीरिया की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए स्कोरिंग और गणना प्रतिशत उपनिवेश द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हम गिनती तक आबादी के भीतर कम से कम 30 नेमाटोड प्रत्येक श्रेणी में गिना जाता है (उपनिवेश की स्थापना के साथ या बिना) के लिए एक विश्वसनीय मूल्य प्राप्त करने की सलाह देते हैं.
  8. जब जनसंख्या में केवल कुछ नेमाटोड उपनिवेश रहे हैं, यह 30 से पहले कई हजार नेमाटोड गिनती कर रहे हैं मनाया आवश्यक हो सकता है. उच्च throughput गिनती के लिए निम्न चरणों का उपयोग करें.
  9. नेमाटोड व्यक्तिगत गिनती के बजाय एक बहु - अच्छी तरह से थाली में, जनसंख्या अशेष भाजक (उदाहरण के लिए एक 24-अच्छी तरह से थाली). बाद नेमाटोड पकवान के नीचे करने के लिए तय हो चुका है, प्रत्येक अच्छी तरह खुर्दबीन पर स्कैन किया जा सकता है और उपनिवेश नेमाटोड की संख्या रन किया जा सकता है.
  10. मैं नेमाटोड की कुल संख्याna आबादी में अच्छी तरह नेमाटोड के धारावाहिक dilutions से पहचाना जा सकता है. उदाहरण के लिए, नेमाटोड के 1 मिलीलीटर में जोड़ा जा सकता है एक अच्छी तरह से एक pipet टिप, और 3 μl के साथ सरगर्मी से अच्छी तरह मिश्रित और हटाया जा सकता है और अच्छी तरह से में कुल जनसंख्या की मात्रा का ठहराव के लिए गिना.
  11. उपनिवेश नेमाटोड के प्रतिशत में अच्छी तरह नेमाटोड की कुल संख्या से उपनिवेश संख्या में विभाजित करके प्राप्त किया जा सकता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

Steinernema Xenorhabdus बैक्टीरिया के साथ जुड़े नेमाटोड के उदाहरण माइक्रोस्कोप छवियों 3 चित्र में दिखाया जाता है. समग्र चित्रा 3A में देखा छवि बनाने के लिए, एक चरण विपरीत छवि एक फ्लोरोसेंट छवि से मढ़ा गया था. चित्रा 3A में तीर इंगित करता है जीवाणु संक्रामक किशोर निमेटोड (बार = 100 सुक्ष्ममापी) के भीतर मौजूद चित्रा 3B एक समान तरीके से निर्माण किया गया था और एक किशोर निमेटोड वाई दर्शाया गया हैवें हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल बैक्टीरिया (हरी छड़) निमेटोड आंतों लुमेन (बार = 20 सुक्ष्ममापी) के दौरान स्थानीय. दो मीडिया से नेमाटोड की आबादी में गिना रहे थे और बैक्टीरियल symbiont (1 टेबल) द्वारा उपनिवेशण के लिए बनाए. मजबूत आँकड़ों के लिए, यह सबसे अच्छा है कम से कम 30 प्रत्येक श्रेणी में गिरने के साथ नमूना प्रति कम से कम 100 नेमाटोड गिनती. तालिका 1 में देखा, इन नेमाटोड लगभग 14.6% की एक स्तर पर उपनिवेश जब लिपिड और अगर 68.6% पर हो जब जिगर, गुर्दे अगर पर हो रहे हैं. अन्य निमेटोड और बैक्टीरियल प्रजातियों उपनिवेशण के विभिन्न स्तरों के लिए दिखाया गया है. एक्स उदाहरण के लिए nematophila एस के 99% colonizes carpocapsae संक्रामक किशोरों (Martens 2003), और पी. एच. के luminescens 26% colonizes bacteriophora संक्रामक किशोरों (2003 Ciche).

चित्रा 1
चित्रा 1. विधि का योजनाबद्ध रूपरेखा. जीवाणु ए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर बी निमेटोड अंडे वयस्क नेमाटोड से अलग कर रहे हैं बाँझ नेमाटोड का उत्पादन. सी. बाँझ नेमाटोड सह फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के साथ खेती की जाती है. डी. परिणामस्वरूप जीवन चरणों के तहत देखा जाता है खुर्दबीन निमेटोड भीतर बैक्टीरियल उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. वयस्क अंडे युक्त महिलाओं का चित्रण. ए योजनाबद्ध Steinernema महिलाओं के सामान्य रूप से पता चलता है. इनसेट: एक एस के डीआईसी छवि feltiae महिला गर्भवती है. काला तीर योनी को इंगित करता है. व्हाइट तीर दिखाई अंडे दिखाते हैं. छवि 20X बढ़ाई है, और पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी एक विकसित लेकिन unhatched एस बी डीआईसी छवि का प्रतिनिधित्व करता है.निमेटोड अंडा feltiae. छवि 40X बढ़ाई है, और पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है सी. अंडे की डीआईसी छवि पृथक एस से 10X आवर्धन के तहत नेमाटोड feltiae. पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी है.

चित्रा 3
चित्रा निमेटोड बैक्टीरियल संघ के 3 उदाहरण माइक्रोस्कोप छवियों. ए.एस. puntauvense नेमाटोड उनके बैक्टीरियल symbiont, एक्स के साथ जुड़े थे bovienii, GFP व्यक्त. छवि एक समग्र देखने का एक ही क्षेत्र से एक फ्लोरोसेंट छवि के साथ एक चरण विपरीत छवि overlaying द्वारा उत्पादित छवि है. तीर निमेटोड मेजबान के भीतर फ्लोरोसेंट बैक्टीरियल symbiont इंगित करता है. स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी बी का प्रतिनिधित्व करता है. यह छवि एक एस से पता चलता है carpocapsae GFP व्यक्त एक्स के साथ किशोर निमेटोड nematophila निमेटोड आंत के भीतर स्थानीय.इस छवि को एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि पर एक फ्लोरोसेंट छवि overlaying के माध्यम से निर्माण किया गया. पैमाने बार 20 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करता है.

तनाव नेमाटोड के साथ acteria संख्या कुल नेमाटोड गिना नेमाटोड का प्रतिशत olonized
एस puntauvense लिपिड अग्रवाल 30 205 14.60%
एस puntauvense जिगर, गुर्दे अग्रवाल 72 105 68.60%

तालिका 1. इस प्रयोग में बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए एक निमेटोड की आबादी का उदाहरण. स्कोरिंग, axenic एस puntauvense नेमाटोड उनके विभिन्न विकास मीडिया पर symbiont GFP व्यक्त (लिपिड और अगर जिगर, गुर्दे 32 अगर) उपनिवेश की स्थापना के लिए दोष परीक्षण के साथ बड़े हो रहे थे. कम से कम एक hundre के कुलनमूना प्रति घ नेमाटोड गिना रहे थे और बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए बने. सांख्यिकीय शक्ति के लिए, तीन प्रयोगात्मक प्रत्येक श्रेणी में गिरने से कम से कम 30 नेमाटोड के साथ गिना जाना चाहिए replicates.

तालिका 2
तालिका 2. फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त plasmids एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रविष्टि के लिए संभावित plasmids के जीवाणु symbiont में सूची दी जाती है प्लाज्मिड के नाम से सूचीबद्ध है. अन्य जानकारी शामिल फ्लोरोसेंट प्रोटीन इनकोडिंग, एंटीबायोटिक प्लाज्मिड रखरखाव के लिए इस्तेमाल किया कैसेट, अन्य उपयोग के लिए निर्देश, प्लाज्मिड के स्रोत हैं. कोष्ठक में विख्यात एकाग्रता एक्स के लिए इस्तेमाल एंटीबायोटिक की एकाग्रता . nematophila इन plasmids के प्रत्येक या तो Xenorhabdus या Photorhabdus में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. अतिरिक्त जानकारी विख्यात प्रशंसा पत्र से प्राप्त किया जा सकता है. निर्भर करता हैजीवाणु पर परीक्षण किया जा रहा है, कुछ plasmids फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एंटीबायोटिक चयन, प्रविष्टि साइट, या प्रतिकृति के मूल पर आधारित काम नहीं कर सकते. ऊपर सूचीबद्ध plasmids अलग विशेषताओं है कि ब्याज के जीवाणु में सक्षम हो सकता है होते हैं. उदाहरण के लिए, गुणसूत्र के attTn7 साइट में मिनी Tn7 - KSGFP आवेषण, जबकि एक्स में pECM20 आवेषण मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा nematophila गुणसूत्र. वैकल्पिक रूप से, pPROBE plasmids extrachromosomally बनाए रखा जाता है, और प्रत्येक प्लाज्मिड pPROBE fluorophore है, लेकिन एक ही रीढ़ की हड्डी और विभिन्न चयन मार्करों या प्रतिकृति का मूल वर्गीकरण संबंधी या उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि की एक किस्म में उनके उपयोग को सक्षम है.

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक निमेटोड मेजबान (1 चित्रा) के भीतर बैक्टीरिया के ऑप्टिकल पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस विधि नेमाटोड पारदर्शिता ऑप्टिकल और fluorescently लेबल बैक्टीरिया की क्षमता का लाभ लेता है, निमेटोड मेजबान (3 चित्रा) के भीतर बैक्टीरिया के vivo विश्लेषण में सक्षम है. विशेष रूप से, इस दृष्टिकोण अपने मेजबान के भीतर बैक्टीरियल स्थानीयकरण को पहचानती है. एक निमेटोड और बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए जनसंख्या स्कोरिंग गिनती, निमेटोड आबादी में जीवाणु उपनिवेशण की आवृत्ति (1 टेबल) निर्धारित किया जा सकता है. यह विधि कई संभावित तकनीक है कि निमेटोड मेजबान और बैक्टीरियल symbionts के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है में से एक है. संबंधित तरीके से पहले किया गया वर्णन किया है बैक्टीरियल symbiont अलग नेमाटोड axenically बढ़ने, और दोनों भागीदारों 25-27 में हेरफेर.

प्रोटोकॉल घंटे वर्णितअरे Xenorhabdus nematophila Steinernema carpocapsae मॉडल 14 प्रणाली में विकसित किया गया था, और इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य entomopathogenic निमेटोड बैक्टीरियल 9,15,17,18 संगठनों में इस्तेमाल किया गया है. कई स्थितियों के क्रम में अन्य निमेटोड बैक्टीरियल प्रणाली के लिए इस पद्धति लागू मुलाकात होगी. सबसे पहले, बैक्टीरियल symbiont मेजबान से अलग हो सकता है और स्वतंत्र रूप से संस्कृति में बड़े हो करने में सक्षम होना चाहिए. दूसरा, symbiont परिवर्तन या विकार के माध्यम से डीएनए लेने के क्रम में फ्लोरोसेंट प्रोटीन शुरू करने में सक्षम होना चाहिए. तीसरा, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, निमेटोड एक मंच है कि axenic और बैक्टीरिया reintroduced बनाया जा सकता है होना चाहिए. बहरहाल, भले ही निमेटोड बैक्टीरिया से अलग नहीं किया जा सकता है यह अभी भी संभव हो सकता है संघ कल्पना हो सकता है: फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के लॉन axenic अंडे जोड़ने के बजाय, एक पारंपरिक जीवन स्तर उठाया जोड़ने और प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के रूप में वर्णित है. कोई परिणाम चेतावनी वें से भुगतना होगाबैक्टीरिया है कि व्यक्त GFP विशिष्ट निमेटोड ऊतकों को स्थानीयकरण के लिए GFP व्यक्त बैक्टीरिया के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए, और इस वजह से, उपनिवेशन सूक्ष्म गिनती नहीं मापा जाना चाहिए. बहरहाल, जब तक बैक्टीरिया कि GFP काफी व्यक्त नहीं करते outcompete GFP-व्यक्त बैक्टीरिया, GFP व्यक्त बैक्टीरिया कम से कम आबादी में कुछ पशुओं में निमेटोड ऊतकों को स्थानीय बनाना और बैक्टीरियल उपनिवेशण के लिए महत्वपूर्ण ऊतक साइटों का सुझाव चाहिए. फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उपभेदों का उपयोग करने की लंबे समय से चली आ रही एक चेतावनी है कि वे एक तनाव है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त नहीं करता है (जैसे 12) की तुलना में अलग अलग क्षमता के साथ एक मेजबान उपनिवेश स्थापित कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल में वर्णित कदम निमेटोड और बैक्टीरियल प्रजातियों कि इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. जीवाणु के विकार के लिए कुछ शर्तों को परिवर्तित किया जा सकता है कि विकास की लंबाई और तापमान, प्राप्तकर्ता को दाता के अनुपात, और प्लाज्मआईडी का इस्तेमाल किया. प्रासंगिक plasmids के उदाहरण 2 तालिका में सूचीबद्ध हैं. इन सभी plasmids के सफलतापूर्वक किया गया है उनके निमेटोड 14,17,20,24,33-35 मेजबान के साथ संघ में या तो Xenorhabdus या Photorhabdus बैक्टीरिया में इस्तेमाल किया. निमेटोड उपनिवेश की स्थापना के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन का स्थिर रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए यह सबसे अच्छा है एक प्लाज्मिड कि लक्ष्य जीवाणु के गुणसूत्र में डालने का उपयोग. इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया इन plasmids नहीं ले सकता है. उदाहरण के लिए, pECM20 केवल एक्स में इस्तेमाल किया गया है nemtaophila और बहुत बारीकी से जीवाणु उपभेदों से संबंधित 14 क्योंकि गुणसूत्र में इस प्लाज्मिड आवेषण प्लाज्मिड और गुणसूत्र के बीच एक मुताबिक़ क्षेत्र का उपयोग कर, प्लाज्मिड अगर लक्ष्य जीवाणु इस क्षेत्र का अभाव नहीं डालने जाएगा. अन्य जीवाणुओं, एक्स के लिए इस प्लाज्मिड का उपयोग nematophila विशिष्ट क्षेत्र लक्ष्य जीवाणु से जीनोमिक क्षेत्र के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. कुछ प्लाज्मिड परिवर्तन योजनाओं को भी होगा r1 प्रोटोकॉल से कुछ परिवर्तन equire. उदाहरण के लिए, मिनी तमिलनाडु 7 KSGFP और PBK miniTn 7-ΩGm DsRed एक प्लाज्मिड सहायक युक्त स्थानांतरण (tsnABCDE) जीन 33,35,36 बैक्टीरियल गुणसूत्र में डालने की आवश्यकता होती है. संयुग्मन सबसे इन 7-आधारित plasmids तमिलनाडु, जब 2 घंटे संस्कृतियों (~ 600 आयुध डिपो 0.3-0.4) बराबर अनुपात में मिलाया जाता है के साथ कुशल है.

सफल विकार के बाद यह सही चयनात्मक प्रयोग किया जाता प्लाज्मिड इसी प्लेटों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. चयनात्मक प्लेटें प्लाज्मिड के प्राप्तकर्ता और दाता और सहायक उपभेदों के खिलाफ एक काउंटर चयन में उपस्थिति के लिए चयन प्लाज्मिड पर encoded एंटीबायोटिक शामिल करना चाहिए. उदाहरण के लिए, जब एक्स में pECM20 conjugating nematophila काउंटर चयन एम्पीसिलीन क्योंकि एक्स nematophila एम्पीसिलीन प्रतिरोधी है और दाता तनाव एम्पीसिलीन संवेदनशील है. यदि एंटीबायोटिक चयन काउंटर y में अनुपलब्ध हैहमारी प्रणाली, एक diaminopimelic (डीएपी) एसिड दाता की आवश्यकता होती है इस्तेमाल किया जा सकता है. उपभेदों विकसित करने के लिए डीएपी की आवश्यकता होती है, डीएपी पूर्व विकार और विकार चरणों के दौरान ठोस और तरल विकास मीडिया को जोड़ा जाता है, और काउंटर चयन चरण के दौरान छोड़े गए. जब डीएपी अनुपस्थित है दाता तनाव बढ़ने नहीं दिया जाएगा और प्रभावी ढंग से जवाबी चयनित है.

सफल अंडा अलगाव सुनिश्चित करने के लिए यह जरूरी है कि सही अंडा उत्पादन (2 चित्रा) के लिए जाँच. अलगाव के समय, महिला नेमाटोड अंडे से भरा हो सकता है और कुछ अंडे मीडिया (2A चित्रा) में दिखाई जानी चाहिए चाहिए. यदि महिला नेमाटोड निषेचित अंडे का उत्पादन कर रहे हैं कम से कम कुछ तैरनेवाला अंडे दिख unhatched नेमाटोड (चित्रा 2B) के रूप में विकसित किया जाएगा. एस के लिए carpocapsae, अंडे गोलाकार से बदलने के लिए थोड़ा नेमाटोड और अंडे सेने के विकास से पहले लंबाकार जाएगा. समय या निमेटोड वृद्धि की शर्तों के भी करने के लिए निषेचित अंडे को अधिकतम करने के लिए परिवर्तित किया जा आवश्यकता हो सकती हैछोटा करने या अंडा कटाई से पहले समय की लंबी अवधि, या विशिष्ट निमेटोड प्रजातियों के लिए उपयुक्त वैकल्पिक मीडिया का उपयोग करने सहित, उपज. अलगाव के अंत में, अंडे (चित्रा 2C) बफर के भीतर आसानी से दिखाई जानी चाहिए. अंडा अलगाव प्रोटोकॉल है कि अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती में पैरामीटर अंडे समाधान में ब्लीच और KOH सांद्रता, अंडा समाधान में ऊष्मायन समय, या centrifugation गति शामिल हैं. यदि अंडे अंडे अलगाव पैदा करता है लेकिन कोई नेमाटोड सह खेती के दौरान विकसित, यह संभव है कि पृथक अंडे अलाभकारी हैं. व्यवहार्यता की जांच करने के लिए, बफर में अलग अंडे को छोड़ने के लिए और इंतजार नेमाटोड के लिए पक्षियों के बच्चे. अंडे अलगाव की एक या दो दिनों के भीतर हैच चाहिए और फिर किशोर नेमाटोड सह खेती परख में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि अंडे हैच, लेकिन सह खेती परख के दौरान विकसित नहीं है, यह विकास की स्थिति या मध्यम सह खेती के लिए इस्तेमाल किया बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है. हम ध्यान दें कि पिछले पढ़ाईएक एंटीबायोटिक कॉकटेल (3,37 जैसे) में नेमाटोड भिगोने से बैक्टीरिया मुक्त नेमाटोड अलग है. दृष्टिकोण हम यहाँ का वर्णन कुछ bacteriostatic एंटीबायोटिक दवाओं, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया contaminating, और नेमाटोड पर एंटीबायोटिक प्रभाव का उपयोग करने के साथ जटिलताओं सहित एंटीबायोटिक भिगोने के निरंतर से मुक्त है. नेमाटोड के कुछ चरणों में भी एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी हो सकता है और उनके बैक्टीरियल symbionts बनाए रखने के तीन. अंत में, हम ध्यान दें कि माइक्रोस्कोपी के लिए, निमेटोड स्थिरीकरण के लिए आवश्यक levamisole की एकाग्रता अलग निमेटोड clades साथ भिन्न हो सकते हैं.

एक बार इस विधि ब्याज की प्रणाली में स्थापित किया गया है, यह संभव है करने के लिए तकनीक को बदलने के लिए और अधिक जानकारी प्राप्त. पहले निमेटोड जीवन चक्र (प्रोटोकॉल 4) में समय बिंदुओं पर देख कर, एक की पहचान कैसे जीवाणु और निमेटोड अपने संघ 14,16 आरंभ करने में सक्षम हो सकता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता हैएक उच्च throughput उत्परिवर्ती बैक्टीरिया सहजीवन में शामिल कारक की पहचान, प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए 17,18 उपनिवेश की स्थापना का पता लगाने के लिए स्क्रीन आचरण ओ. हस्ताक्षर टैग mutagenesis के रूप में इस तरह के अन्य तरीकों radioactively लेबल जांच के उपयोग की आवश्यकता होती है और अधिक 22,28 समय लेने हैं. इसलिए, नेमाटोड में बैक्टीरिया symbiont दृश्य के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक निमेटोड मेजबान के साथ बातचीत बैक्टीरिया की जांच करने के लिए एक प्रभावी और कुशल स्क्रीनिंग उपकरण है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए उनके योगदान के लिए Eugenio Vivas कर्ट Heungens, एरिक Martens, चार्ल्स Cowles, Darby चीनी, एरिक Stabb, और टोड Ciche इस प्रोटोकॉल और उपकरणों का इस्तेमाल विकास के लिए शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. केईएम और जेएमसी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा T32 पुरस्कार (AI55397 "स्वास्थ्य और रोग में रोगाणुओं") द्वारा समर्थित थे. जेएमसी एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS ०९२०६३१ और IOS-0,950,873) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipid Agar
(sterile)		 8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)		 7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)		 5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)		 8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM

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References

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माइक्रोबायोलॉजी 68 अंक आण्विक जीवविज्ञान जीवाणु विकास जीवविज्ञान औपनिवेशीकरण, सहजीवन निमेटोड बैक्टीरिया प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग नेमाटोड में जीवाणु Visualizing
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Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).

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