Summary
שיטה של מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.
Abstract
פלסמידים כמה טבעי, נשמרים בתאי יונקים. בין אלה הגנומים של גאמה, herpesviruses, כולל Epstein-Barr וירוס (EBV) וסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של קפוסי (KSHV), הגורם לממאירויות אדם מרובה 1-3. 2 גנומים אלו משוכפלים באופן מורשה, כל שימוש בחלבון נגיפי אחת ומכונות שכפול תאים, ומועברים לתאי בת בעת חלוקת תא למרות centromeres המסורתי החסר 4-8.
עבודה רבה נעשתה כדי לאפיין את החזרות של הגנום פלסמיד אלה באמצעות שיטות כגון סופג דרום ופלואורסצנטי כלאה באתר (FISH). למרות ששיטות אלו מוגבלות,. כתמי דרום כמותית PCR ולספק מידע על המספר הממוצע של פלסמידים לתא באוכלוסייה של תאים. דגים הם assay תא בודד שמגלה גם את המספר הממוצע וההפצה של פלסמיד תא לים באוכלוסייה של תאים, אבל הוא סטטי, ומאפשר אין מידע על ההורה או צאצאים של התא הנבדק.
כאן, אנו מתארים שיטה להמחשת פלסמידים בתאים חיים. שיטה זו מבוססת על הכריכה של חלבון מדכא קטוז מתויג fluorescently לאתרים מרובים בפלסמיד עניין 9. ה-DNA של עניין מתוכננת לכלול כ 250 חזרות טנדם של מפעיל קטוז (אץ) הרצף. אצו קשור באופן ספציפי על ידי החלבון המדכא קטוז (לאצים), אשר ניתן התמזג לחלבון פלואורסצנטי. חלבון היתוך אחד יכול לבוא לידי ביטוי מפלסמיד המהונדס או הוצג על ידי וקטור retroviral. בדרך זו, מולקולות DNA מתויגות fluorescently ולכן הפכו לגלוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבון ההיתוך חסום מקשירת DNA פלסמיד ידי תאי culturing בנוכחות IPTG עד פלסמידים מוכנים להצגה.
ontent "> מערכת זו מאפשרת את פלסמידים כדי להיות במעקב בתאים חיים דרך כמה דורות, מגלים מאפיינים של הסינתזה שלהם וחלוקה לתאי בת. תאים אידיאליים הם חסיד, transfected בקלות, ויש גרעינים גדולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לקבוע כי 84% מפלסמידים EBV-derived מסונתזים כל דור ו88% ממחיצת פלסמידים המסונתזים חדש בנאמנות לתאי בת בתאי הלה. זוגות של פלסמידים EBV האלה נצפו יהיו כבולים לאו קשור chromatids אחות לאחר הסינתזה שלהם בS- שלב, עד שהם ראו להפריד כchromatids האחות מופרדת בAnaphase 10. השיטה נמצא בשימוש ללמוד שכפול של הגנום בתאי הלה KSHV ותאי SLK. תאי הלה הונצחו תאי האפיתל אדם, ותאי SLK הונצחו אנושי אנדותל תאים. למרות שתאי SLK הופקו במקור מנגע KSHV, לא הלה ולא שורת תאי SLK אופן טבעי חרבהגנום ORS KSHV 11. בנוסף לומד שכפול נגיפי, טכניקת הדמיה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעות של בנוסף, הסרה, או המוטציה של אלמנטי רצף הדנ"א שונים על סינתזה, לוקליזציה, ומחיצות של DNAs פלסמיד רקומביננטי האחר.Protocol
1. הנדסה של תאים עם פלסמידים גלויים
- השתמש עיכול הגבלה סטנדרטי או הומולוגית רקומבינציה טכניקות להציג קטע DNA המכיל כ 250 עותקים של רצף מפעיל קטוז (אץ) לתוך פלסמיד להיות דמיינו. הפלסמיד שלנו היה BACmid של כ 170 KBP והכיל את כל הגנום של נגיף הרפס סרקומה ע"ש קאפושי הקשורה של (KSHV) והתנגדות מקודדת עד 12 hygromycin.
- להציג אץ המכיל DNA פלסמיד לתוך תאי יונקים ידי transfection עם Lipofectamine 2000. אנו transfected תאי הלה וSLK ב 60 מנות מ"מ עבור 4 שעות עם 10 מיקרוגרם מטוהרי DNA פלסמיד עם 25 Lipofectamine μl 2000, המ"ל OptiMEM 0.5, והמ"ל DMEM 3.5.
- לשנות את התרבות הבינונית עד 5 המ"ל DMEM עם 10% תאים עובריים שור בסרום ודגירה במשך 48 שעות.
- פלייט התאים בצפיפות נמוכה במנות גדולות ותאי תרבות במדיום המכילים מבחר אנטיביוטיקה לPLA הציגשמייד, אנחנו בחרנו בתאי DMEM עם סרום שור עוברי 10% עם 300 מיקרוגרם / המ"ל hygromycin למשך 3 שבועות.
- השתמש בפיסות נייר סטרילי, טריפסין ספוג מסנן להעביר מושבות hygromycin עמידות למנות התרבות חדשות.
- כאשר שיבוטי transfected גדלו למלא את הצלחת, לבודד DNA לעיכול הגבלה והדרום סופג כדי להבטיח שהפולימר של אצו פלסמיד הוא הומוגני ושל הגודל צפוי.
- אם פלסמיד לא הונדס היתוך של אצים, להדביק שיבוטים מתאימים עם רטרווירוס קידוד קטוז המדכא (לאצים) התמזג לחלבון פלואורסצנטי אדום, כמו אצים-tdTomato. אנו משתמשים tdTomato במקום חלבונים כי לזרוח קרובים יותר לצבע ירוק כדי למזער photoxicity שיתרחש מחשיפות מרובות על פני זמנים ארוכים 13.
- ברגע שחלבון היתוך האצים הוא הציג, תרבות התאים בנוכחות 200 מיקרוגרם / המ"ל איזופרופיל-BD-thiogalactoside (IPTG) לחסום את חלבוני היתוך מלהיקשרה-DNA.
- תרבות התאים ללפחות 3 ימים כדי לאפשר ביטוי של חלבון אצים-tdTomato.
- שיבוטי מסך (על ידי שטיפת IPTG וצפייה בתאים, כמתואר בהמשך) לאלו עם רמות אופטימליות של אצים-tdTomato החושפות אותות שונים עם רמות רקע מינימאליים של חלבון היתוך לא מאוגד.
2. פיתוח של מערכת ההדמיה
מערכת ההדמיה שלנו מורכבת של 200 מיליון Zeiss Axiovert מצוידים בשלב ממונע ומטרת תכנית-Aochromat 63x/1.4 נפט. אור פלואורסצנטי עירור מסופק על ידי "הניטראלי הלבן" LED של מערכת קוליברי. פליטה הוא זוהה על ידי CascadeII: מצלמת 1024 EMCCD. זוהי מצלמה מקוררת, דללה גב עם אוגר שבח להגברת אותות; זרם החושך הוא 0.061 אלקטרונים לכל פיקסל לשנייה, ואת היעילות הקוונטית גבוהה מ -0.90. המערכת נשלטת על ידי 4.8 AxioVision תוכנה, כולל מודול SmartExperiments. לצורך זיהוי של tdTomaלאנו משתמשים ב75HE להגדיר את מסנן Zeiss אשר 85% מהאור עובר יכולים לרגש פלואוריד ו95% מהאור הנפלט יעבור סינון הפליטה.
- להרכיב מערכת הדמיה עם מיקרוסקופ הפוך ומצלמת EMCCD לגילוי רגיש של אותות, מקור אור LED לעירור ספציפי ומהירים shuttering, שלב ממונע וזרוע פוקוס, ושליטת תוכנה עבור רכישות אוטומטיות של תמונות על מרווחי זמן ארוכים עם מספר רב של Z-ערימות. המערכת צריכה לשבת על שולחן אוויר להיות מבודד מרעידות.
- להרכיב חממת שלב עליון לשמור על תאים על 37 המעלות צלזיוס,% CO 05-10 פבואר בתא humidified. לאפשר מספיק זמן למערכת להגיע לטמפרטורה יציבה כדי למזער את חפצי תנועה במהלך הניסוי.
- השתמש צווארון מחומם למטרה למנוע מאובייקטיבי siphoning חום מהמדגם.
3. ויזואליזציה של ה-DNA שכותרת
- תאי פלייט ב35 מ"מצלחת תחתית זכוכית בצפיפות של מפגש פחות מ 10%, אשר תאפשר זוגות של תאים לחלוקה למושבות של 8-16 תאים ללא חפיפה. האם לפחות 24-48 שעות לפני ההדמיה, כך שתאי הקיימא לי זמן לחלק.
- שעות עד שלוש לפני תחילת ההדמיה, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מדיום התרבות שאין בה שתי תרופות וIPTG סלקטיבית. הליך זה שוטף את התאים שאינם בנות קיימא ומאפשר לחלבוני היתוך אצים לקשור אתרים לאץ בפלסמידים.
- החלף את התרבות הבינונית עם 2 המ"ל DMEM עם סרום 10% שור עוברי ו25 HEPES מ"מ.
- החלף את החלק העליון של צלחת התרבות עם CultFoil נמתח בטבעת הרכבת מנה 35 מ"מ. כיסוי זה ימנע אידוי של מדיום התרבות, אשר היה להגדיל את ריכוז מלח לאורך זמן ולהרוג את התאים.
- השתמש הפרש הפרעות ניגוד הדמיה (DIC) כדי להציג את התאים ולקבוע את מישור המוקד של החלק העליון והתחתון של התאים בתחומים מרובים של תצוגה.בכל תחום, לעבור למישור מוקד של כ 1/3 מהדרך למטה מהפסגה של התא. שמור את x, y, z קואורדינטות בשורת תפקידים במה שנשמר.
הערה: אותות פלסמיד לא יכולים להיות גלויים דרך העינית כאשר תאים מוארים בנוריות של אורך הגל המתאים לחלבון היתוך האצים. אותות חלשים עשויים להיות גלויים עם השימוש במצלמת EMCCD, המאפשרת אינטגרציה של האות לאורך זמן ובכך מגבירה את היעילות אותות חלשים בלבד. - בתוכנת שליטת מיקרוסקופ, מגדיר Z-מחסנית של תמונות שיש לבצע בכל עמדת במה נשמרה. בחר את גודל צעד של 0.35-0.50 az מיקרומטר, שיאפשר לך דגימת נייקוויסט משוערת בממד z 14. כוללים פרוסות "תוספת" מעל ומתחת למטוסים שבו נמצאים תאים; פרוסות אלה מאפשרים זיהוי בעקבות תנועות תא במהלך מחזור התא, ומשמשות גם בעיבוד שלאחר הרכישה (deconvolution) מהערימות של התמונות. הכללה זו תהיהלגרום לערימה של 40-60 תמונות, בהתאם לעובי של התאים.
- בתוכנת שליטת מיקרוסקופ, להגדיר ניסוי סדרת זמן לאסוף את תמונת שדה בהירה של Z-הערימות ב 30 מרווחי דקות (למעקב חלוקות והגירות על זמנים ארוכים) ותמונות בקרינת 10-60 דקות מרווחים (להמחשת פלסמידים בתוך תאים). אין להשתמש בהדמית דסק"ש במהלך הניסוי, כפי שהוא דורש יותר אור מהדמיה הסטנדרטית בהירה שדה, אשר יכול לחשוף את התאים שלא לצורך לphototoxicity במהלך ניסויים ארוכים.
- להתחיל בניסוי תוכנת השליטה. ודא שהמערכת אינה מופרעת (התנגש, נחשף לאור חדר עודף, וכו ') במהלך הניסוי.
- במידת צורך, לחדש את המים במערכת humidification במהלך הניסוי.
4. עיבוד שלאחר הרכישה של תמונות
- סקור את התמונות לכל נקודת z מחסנית, וזמן. לחתוך את כל אזורים מיותרים שלאת התמונות כדי להפחית את זמן עיבוד המחשב בשלב הבא.
- השתמש באלגוריתם deconvolution ללהקצות מחדש עוצמת אות לפיקסל ממוצא בכל Z-מחסנית 15. אמנם יכול להיות מבוסס deconvolution זה על תפקוד התפשטות נקודה תיאורטית למערכת ההדמיה שלך, עדיף למדוד את תפקוד נקודת ההתפשטות של המערכת המסוימת שלך על ידי הדמית הניאון microspheres, ולהשתמש במדידה זו באלגוריתם deconvolution. אנחנו מדדנו את תפקוד התפשטות נקודת מערכת ההדמיה שלנו וליישם מוגבל איטרטיבי אלגוריתם סיכוי מרבי בAxioVision תוכנה (תיאור AxioVision תוכנה, Zeiss).
- לבחון את הדימויים כדי לעקוב אחר השינויים בעצמה והתנועות של פלסמידים במהלך מחזור התא וחלוקתה של פלסמידים לתאי בת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחזיות עוצמתו מרבית של Z-ערימות נרכשו בניסוי נציג מוצגות באיור 3. אותות פלסמיד אופייניים הם הווה ב3-8 פרוסות של Z-המחסנית, תלויים אם הם מייצגים בודדים או קבוצות של פלסמידים. במקרה של-EBV ופלסמידים KSHV-derived, האותות לנוע באיטיות בתוך התא עד שהתא מגיע מיטוזה. התאים עצמם נודדים במהלך הניסוי. הם גם הפכו כדוריים ולהתנתק מהצלחת במהלך מיטוזה. מחזור התא לתאי הלה וSLK בריאים לוקח כ 24 שעות, תאים מסוגים אלה שלוקחים יותר מ 30 שעות כדי להשלים את מחזור התא צריכים להיחשב בריאים. תאי בת בדרך כלל לצרף אחד ליד שני ולהמשיך לחלק באותו הזמן במחזור התא הבא. תאים יחידים שעשויה להיות מוצג כדי להשלים מחזור תא צריכים להיות מנותחים.
05/4305fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
איור 1. ערכה להכנת פלסמידים גלויים. () חוזר טנדם של רצף מפעיל קטוז (אץ) משבטים לתוך פלסמיד של עניין. החלבון המדכא קטוז (לאצים) נקשר באופן ספציפי לרצפים האלה; היתוך לחלבון פלואורסצנטי מגייס ניאון התג לפלסמיד של עניין. (B ו-C) לגרעין של תא הלה מביע אצים-tdTomato הוא ניאון עקב אות הלוקליזציה הגרעינית בחלבון ההיתוך localizing לגרעין. הגנום KSHV קידוד רצפי אצו לגייס עותקים רבים של החלבון פלואורסצנטי ועומד בתור אותות בהירים על רקע העצמה של הגרעין בהעדר IPTG (ב '), ואילו חלבוני אצים-הניאון הם מנעו להיקשר לאצו רצף הכרה ב הנוכחות של IPTG (C). תמונות אלה עשויים לכלול מחשוב z מטוסים מרובים שבו האותות השונים מתגוררים.
-Together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2. תרשים של הליך הדמית פלסמיד. ראשית, חוזר טנדם האץ משבטים לתוך פלסמיד של עניין. פלסמיד שמוחדר לתאים על ידי transfection. שיבוטים של תאי transfected נבחרים והוקרנו, ולאחר מכן נגוע ברטרווירוס מבטא חלבון היתוך אצי ניאון.
איור 3. סקור תמונות כדי לעקוב פלסמידים לאורך מחזור התא. הגנום נגיפי מתויג fluorescently בתא הלה () מסונתז בשלב ה-S-(B) ומחולק למחיצות לתאי בת בעת חלוקת תא (CE) ויכול להיות במעקב במשך מספר דורות. הראו תחזיות הן בעצמה מרבית של Z-ערימות נרכשו של מחזור תא הלה בחמש נקודתי זמן בניסוי נציג. תמונות אלה נעשות כמו בתרשים 1B ו-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב פלסמידים בתאי יונקים חיים לאורך הזמן הפורש מספר דורות. על ידי הגבלת חשיפה לאור עירור, יש לנו להשתמש בטכניקות אלה כדי לעקוב אחר תאים מזוגות שזה עתה מחולק באמצעות מושבות של 16-32 תאים, ובה לפחות 72 שעות ו3 חטיבות סלולריות. ניסויים אלו מספקים מידע שלא ניתן לקבל ממבחנים סטטיים כגון כמותית PCR, דרום סופג, ודגים.
זה חיוני כדי להקרין את השיבוטים של תאים לפלסמידים עם מבנה אחיד, כשחלופים יכולים להתרחש בעת שימוש בפלסמידים עם רצפים חוזרים כגון את החזרות טנדם לאץ. בנוסף, הוא שימושי כדי לייעל זיהום רטרווירוס ושיבוטי מסך של תאים נגועים לעוצמת אות אופטימלית. תאים המבטאים את חלבון אצים יותר מדי יהיו קרינת רקע גבוהה בגרעין, ואלו מעט מדי הבעה יהיו אותות חלשים. לבסוף, זה אניחשוב להסתכל על המורפולוגיה של תא ולבחור תאים בריאים בעת סימון שדות מבט לשימוש במהלך ההדמיה שלהם.
טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחזות כמעט כל מולקולת הדנ"א, בתנאי שהוא יכול להיות מהונדס כולל חזרות טנדם של הרצף לאץ. דוגמאות כוללות כרומוזומים סלולריים, פלסמידים טבעיים ומלאכותיים, וגנומים נגיפיים ארוזים בתוך virions. בניסויים דומים לזה מתואר באיור 3, מצא כי פלסמידים KSHV-derived להיראות חולקו באופן אקראי בעת חלוקת תא. רחבה הגיונית של הטכניקה היא לתייג את מולקולת הדנ"א אחד כזוג לאץ / אצים עם חלבון אחד ניאון, ומולקולת דנ"א אחרת באותו תא כמפעיל טטרציקלין / זוג repressor Tetetracycline עם חלבון פלואורסצנטי אחר. ניסויים מוגבלים על ידי כמות אור עירור התאים יכול לעמוד לפני חווה השפעות רעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות וACS, כולל T32CA009135, CA133027, CA070723, וCA022443. ביל סאגד הוא פרופסור מחקר אגודה אמריקאי לסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Fields Virology 2 volume set. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).
