Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia
Summary
Un método de observación de moléculas individuales de ADN en células vivas se describe. La técnica se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia represor lac a sitios de unión ingeniería genética en el ADN de interés. Este método puede ser adaptado para seguir muchos ADNs recombinantes en células vivas en el tiempo.
Abstract
Pocos plásmidos de origen natural se mantienen en células de mamífero. Entre éstos están los genomas de gamma-herpesvirus, incluyendo el virus de Epstein-Barr (EBV) y el sarcoma de Kaposi asociado a herpesvirus (KSHV), que provocan múltiples malignidades humanas 1-3. Estos dos genomas se replican de manera autorizada, cada uno usando una sola proteína viral y maquinaria de replicación celular, y se pasan a las células hijas durante la división celular a pesar de que carecen de sus centrómeros tradicionales 4-8.
Mucho trabajo se ha realizado para caracterizar las repeticiones de estos genomas plásmido utilizando métodos tales como Southern blot y la hibridación fluorescente in situ (FISH). Estos métodos están limitados, sin embargo. PCR cuantitativa y las transferencias de Southern proporcionar información sobre el número medio de plásmidos por célula en una población de células. La FISH es un ensayo de una sola célula que revela tanto el número medio y la distribución de plásmido s por célula en la población de células, pero es estática, no permitiendo ninguna información sobre el padre o progenie de la célula examinada.
Aquí se describe un método para visualizar los plásmidos en células vivas. Este método se basa en la unión de una proteína marcada con fluorescencia lactosa represor a múltiples sitios en el plásmido de interés 9. El DNA de interés está diseñada para incluir aproximadamente 250 repeticiones en tándem del operador lactosa (LACO) secuencia. Laco es unido específicamente por la proteína represora de la lactosa (LacI), que puede ser fusionada con una proteína fluorescente. La proteína de fusión puede expresarse a partir del plásmido de ingeniería o introducida por un vector retroviral. De esta manera, las moléculas de ADN están marcados fluorescentemente y por lo tanto se hacen visibles a través de microscopía de fluorescencia. La proteína de fusión se bloquea la unión de la ADN plasmídico por cultivo de células en presencia de IPTG hasta los plásmidos están listos para ser visto.
ONTENIDO "> Este sistema permite que los plásmidos sea controlados en células vivas a través de varias generaciones, revelando propiedades de su síntesis y la partición a las células hijas. células ideales son adherente, fácilmente transfectadas, y tienen núcleos grandes. Esta técnica se ha utilizado para determinar que 84% de EBV derivados de plásmidos se sintetizan cada generación y 88% de la partición recién sintetizado plásmidos fielmente a las células hijas en células HeLa. pares de estos plásmidos EBV se observaron a ser atados o asociado a las cromátidas hermanas después de su síntesis en S- fase hasta que se observaron para separar como las cromátidas hermanas en la anafase separados 10. El método se está utilizando actualmente para estudiar la replicación de los genomas HVSK en células HeLa y células SLK. células HeLa se inmortalizan las células epiteliales humanas, y las células inmortalizadas se SLK endoteliales humanas las células. Aunque las células SLK se derivaron originalmente de una lesión KSHV, ni la línea HeLa ni SLK celular naturalmente harbors HVSK genomas 11. Además de estudiar la replicación viral, esta técnica de visualización se puede utilizar para investigar los efectos de la adición, eliminación o mutación de los diversos elementos de secuencia de ADN en la síntesis, la localización, y la partición de otros ADN de los plásmidos recombinantes.Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí se puede utilizar para seguir los plásmidos en células de mamíferos vivos en el tiempo que abarca múltiples generaciones. Al limitar la exposición a la luz de excitación, hemos utilizado estas técnicas para seguir las células de parejas recién divididas a través de las colonias de 16-32 células, lo que representa por lo menos 72 horas y 3 divisiones celulares. Estos experimentos proporcionan información que no puede obtenerse a partir de ensayos estáticos, tales como PCR cuantitati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH y ACS, incluyendo T32CA009135, CA133027, CA070723, y CA022443. Bill Sugden es una Sociedad Americana del Cáncer Profesor de Investigación.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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