라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.
몇 자연스럽게 – 발생 plasmids은 포유류의 세포에 보관됩니다. 이 중 여러 사람이 malignancies 1-3의 원인 엡스타인 – 바 바이러스 (EBV)와 Kaposi 육종 – 관련 herpesvirus (KSHV)를 포함 감마 herpesviruses의 genomes이 있습니다. 이 두 genomes들은 부족 전통 centromeres 4-8에도 불구하고 라이센스 방식으로, 하나의 바이러스 단백질과 세포의 복제 기계를 사용하여 각 복제하고 있으며, 세포 분열 동안 딸 세포에 전달됩니다.
많은 작품은 그러한 남부 blotting 및 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광과 같은 방법을 사용하여 이러한 플라스미드 genomes의 복제를 특징 완료되었습니다. 이러한 방법은하지만 제한됩니다. 양적 PCR 및 남부 blots은 세포의 인구 세포 당 plasmids의 평균 개수에 대한 정보를 제공합니다. 물고기는 평균 수와 플라스미드의 배포를 모두 보여 단일 셀 분석입니다 하지만 세포 인구의 당 세포 검사 셀의 부모 나 자손에 대한 정보를 허용하지 정적입니다.
여기, 우리는 라이브 셀의 plasmids를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 관심을 9 플라스미드의 여러 사이트에 휘황 태그 유당 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 관심 DNA는 유당 연산자 (LacO) 시퀀스의 약 250 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되어 있습니다. LacO은 특히 형광 단백질에 융합 할 수있는 유당 억제 단백질 (LacI)에 의해 구속된다. 융합 단백질은 하나 엔지니어링 플라스미드 또는 retroviral 벡터에 의해 도입에서 표현 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, DNA 분자는 휘황 태그하므로 형광 현미경을 통해 볼 수가 있습니다. plasmids이 볼 수 할 준비가 될 때까지 융합 단백질은 IPTG의 존재의 배양 세포에 의해 플라스미드 DNA를 바인딩에서 차단됩니다.
ontent는 ">이 시스템은 plasmids은 여러 세대에 걸쳐 세포를 생활의 합성의 속성을 드러내고과 딸 세포에 파티션에서 모니터 할 수 있습니다. 이상적인 세포가 자기편 있으며, 쉽게 transfected, 대형 핵을 갖추고 있습니다.이 기술은 결정하는 데 사용 된 것으로 EBV-파생 plasmids의 84 %가 각 세대를 합성하고 새로 합성 plasmids 파티션의 88 %가 충실하게 헬러 셀의 딸 세포에.이 EBV의 plasmids의 페어가에서 자신의 합성 이후에 묶여 또는 자매 chromatids와 관련된 것으로 볼 수 있었다 S- 그들이 Anaphase 10 구분 자매 chromatids로 분리 볼 때까지 단계가. 방법은 현재 헬러 셀 및 SLK 세포에서 KSHV의 genomes의 복제를 연구하는 데 사용하고 있습니다. 헬러 세포는 인간의 상피 세포를 불후의하고 있으며, SLK 셀이 남을 아르 내피 인간 세포. SLK 세포가 원래 KSHV의 병변에서 파생 된 있지만, 헬러이나 SLK 셀 라인도 자연스럽게 harbors KSHV의 genomes 11. 바이러스 복제를 공부하는 것 외에도,이 시각화 기술은 또한, 제거, 또는 합성, 현지화 및 기타 재조합 플라스미드 DNAs의 파티션에 대한 다양한 DNA 시퀀스 요소의 돌연변이의 효과를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.여기에 설명 된 방법은 여러 세대에 걸쳐 시간이 지남에 따라 실시간으로 포유류의 세포에 plasmids를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 여기 빛에 노출을 제한함으로써, 우리는 최소 72 시간, 3 셀 부문을 대표하는 16-32 세포의 콜로니를 통해 새로 분할 쌍의 세포를 수행하는 이러한 기술을 사용했습니다. 이 실험은 정량 PCR, blotting 남부 및 어류와 같은 정적 assays에서 얻을 수없는 정보를 제공합니다….
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH와 ACS, T32CA009135 포함 CA133027, CA070723 및 CA022443에서 교부금의 지원을받는되었다. 빌 Sugden은 미국 암 협회 연구 교수입니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | GIBCO | 11965 | |
OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Penicillin | Sigma | P3032 | |
Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
HEPES | GIBCO | 15630 | |
Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
Axiovert 200M | Zeiss | ||
Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |