Summary
Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.
Abstract
Pochi plasmidi presenti naturalmente sono mantenuti in cellule di mammifero. Tra questi sono genomi di gamma-herpesvirus, incluse Epstein-Barr (EBV) e sarcoma di Kaposi associato herpesvirus (KSHV), che causano più malignità umane 1-3. Questi due genomi sono replicati in modo licenza, ciascuno utilizzando una singola proteina virale e macchinari replicazione cellulare, e sono passati alle cellule figlie durante la divisione cellulare, nonostante i loro centromeri privi tradizionali 4-8.
Molto lavoro è stato fatto per caratterizzare le repliche di questi genomi plasmide utilizzando metodi come assorbente meridionale e ibridazione in situ fluorescente (FISH). Questi metodi sono limitati, però. Quantitativa PCR e Southern blot fornire informazioni circa il numero medio di plasmidi per cellula in una popolazione di cellule. FISH è una cella singola saggio che rivela il numero medio e la distribuzione del plasmide s per cella nella popolazione di cellule, ma è statico, permettendo alcuna informazione circa il genitore o progenie della cellula esaminata.
Qui, si descrive un metodo per la visualizzazione plasmidi in cellule vive. Questo metodo è basato sul legame di una proteina fluorescente etichettato lattosio repressore di diversi siti del plasmide di interesse 9. Il DNA di interesse è progettato con circa 250 ripetizioni in tandem dell'operatore lattosio (Laco) sequenza. Laco è specificamente legato dalla proteina repressore lattosio (LacI), che può essere fusa ad una proteina fluorescente. La proteina di fusione può essere espresso dal plasmide ingegnerizzato o introdotto da un vettore retrovirale. In questo modo, le molecole di DNA vengono fluorescently etichettato e quindi diventano visibili tramite microscopia a fluorescenza. La proteina di fusione è bloccato da legare il DNA plasmidico da cellule di coltura in presenza di IPTG finché i plasmidi sono pronti per essere visti.
ONTENUTO "> Questo sistema permette i plasmidi da monitorare in cellule viventi per diverse generazioni, rivelando proprietà dei loro sintesi e partizionamento cellule figlie. ideali sono cellule aderenti, facilmente trasfettate, e hanno grandi nuclei. Questa tecnica è stata utilizzata per determinare che 84% di EBV-derivati plasmidi sono sintetizzati ogni generazione e l'88% della partizione di nuova sintesi plasmidi fedelmente alle cellule figlie in cellule HeLa. Coppie di questi plasmidi EBV sono stati visti da essere legati o associati ai cromatidi fratelli dopo la loro sintesi in S- fase fino a quando non sono stati visti per separare i cromatidi fratelli separati in anafase 10. Il metodo è attualmente utilizzato per studiare la replicazione dei genomi KSHV in cellule HeLa e cellule SLK. cellule HeLa sono immortalati cellule epiteliali umane, e le cellule SLK sono immortalati endoteliali umane cellule. Anche se le cellule SLK sono stati originariamente derivato da una lesione KSHV, né la linea di cellule HeLa, né SLK naturalmente harbors genomi KSHV 11. Oltre a studiare la replicazione virale, questa tecnica di visualizzazione può essere usato per studiare gli effetti l'aggiunta, la rimozione o la mutazione dei vari elementi di sequenza del DNA di sintesi, la localizzazione e il partizionamento di altri DNA plasmidico ricombinante.Protocol
1. Ingegneria delle cellule con plasmidi visibili
- Utilizzare digestione normale restrizione o tecniche di ricombinazione omologa per introdurre un frammento di DNA contenente circa 250 copie della sequenza dell'operatore lattosio (Laco) nel plasmide da visualizzare. Il nostro è stato un plasmide BACmid di circa 170 kbp e conteneva l'intero genoma di Kaposi sarcoma-associated virus Herpes (KSHV) e resistenza codificato igromicina 12.
- Introdurre LACO contenenti DNA plasmidico in cellule di mammifero mediante trasfezione con Lipofectamine 2000. Noi cellule HeLa trasfettate e SLK in 60 piatti mm per 4 ore con 10 pg di DNA plasmidico purificato con 25 pl Lipofectamine 2000, 0,5 ml OptiMEM, e 3,5 ml DMEM.
- Modificare il terreno di coltura per 5 ml DMEM con 10% siero fetale bovino cellule e incubare per 48 hr.
- Piatto le cellule a bassa densità in piatti grandi e le cellule di coltura in terreno contenente una selezione antibiotico per l'introduzione plasmid; abbiamo selezionato cellule in DMEM con 10% di siero fetale bovino con 300 ug / ml di igromicina per 3 settimane.
- Utilizzare pezzi di sterile, tripsina imbevuta di carta da filtro per il trasferimento igromicina resistenti colonie per piastre di coltura di nuove.
- Quando cloni trasfettati sono cresciuti a riempire il piatto, isolare DNA per la digestione di restrizione e Southern blotting per garantire che il polimero del plasmide Laco è omogenea e della dimensione attesa.
- Se il plasmide non è stata ingegnerizzata per esprimere una fusione di LacI, infettare cloni giusti con un retrovirus codificante il repressore lattosio (LacI) fuse ad una proteina fluorescente rossa, come LacI-tdTomato. Usiamo tdTomato piuttosto che le proteine che reagiscono più vicino al verde per ridurre al minimo photoxicity che si verificherebbe da esposizioni multiple tempi lunghi oltre 13.
- Una volta che la proteina di fusione LacI viene introdotto, coltivare le cellule in presenza di 200 mg / ml isopropil-bD-tiogalattoside (IPTG) per bloccare le proteine di fusione di legameDNA.
- Cultura le cellule per almeno 3 giorni per consentire l'espressione del LacI tdTomato-proteina.
- Cloni schermo (lavando via il IPTG e la visualizzazione di cellule come descritto di seguito) per quelli con livelli ottimali di LacI-tdTomato che rivelano segnali distinti, con livelli di fondo minimo di proteine di fusione non legato.
2. Sviluppo del sistema di imaging
Il nostro sistema di imaging consiste in un 200M Axiovert Zeiss dotata di un palco motorizzata e Plan-Aochromat 63x/1.4 obiettivo olio. Luce di eccitazione di fluorescenza è fornito dalla "bianco neutro" LED di un sistema Colibri. Emissione viene rilevata da un CascadeII: 1024 EMCCD fotocamera. Questa è una soluzione raffreddata, telecamera posteriore diluito con un registro di guadagno per amplificare i segnali, la corrente di buio è 0,061 elettroni per pixel per secondo, e l'efficienza quantica è maggiore di 0,90. Il sistema è controllato da AxioVision 4,8 software, compreso il modulo SmartExperiments. Per il rilevamento di tdTomautilizzare abbiamo un filtro 75HE Zeiss insieme per la quale l'85% della luce passa può eccitare il fluoro e il 95% della luce emessa passerà il filtro per le emissioni.
- Assemblare un sistema di imaging con un microscopio invertito e una telecamera EMCCD per rivelazione sensibile di segnali, una sorgente di luce LED per eccitazione specifica e veloce casseforme, una fase braccio motorizzato e fuoco, e software di controllo per l'acquisizione automatica di immagini su intervalli di tempo lunghi con multiple z-stack. Il sistema dovrebbe sedersi su un tavolo aria isolata da vibrazioni.
- Assemblare una fase-top incubatore per mantenere le cellule a 37 ° C, 5-10% di CO 2 in una camera umidificata. Tempo sufficiente per il sistema di arrivare ad una temperatura stabile per minimizzare gli artefatti di movimento durante l'esperimento.
- Utilizzare un collare riscaldato per l'obiettivo di evitare l'obiettivo riflusso calore dal campione.
3. Visualizzazione del DNA con etichetta
- Cellule portapiatti in 35 mmfondo di vetro piatto ad una densità inferiore al 10% di confluenza, che consentirà coppie di cellule a dividersi in colonie di 8-16 cellule senza sovrapposizioni. Fate questo almeno 24-48 ore prima di imaging in modo che le cellule vitali hanno il tempo di dividersi.
- Uno a tre ore prima dell'inizio imaging, lavare la piastra 3 volte con terreno di coltura che manca di entrambi i farmaci selettivi e IPTG. Questa procedura lava via non vitali delle cellule e permette di Laci proteine di fusione di legare siti Laco nei plasmidi.
- Sostituire il mezzo di coltura con 2 ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino e 25 mM HEPES.
- Sostituire la parte superiore del piatto di coltura con CultFoil allungato in un anello di montaggio per un piatto 35 mm. Questo coperchio inibirà evaporazione del terreno di coltura, che aumenterebbe concentrazione di sale nel tempo e uccidere le cellule.
- Utilizzare contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging per visualizzare le cellule e determinare il piano focale della parte superiore e inferiore delle celle in più campi di vista.In ogni campo, spostarsi in un piano focale circa 1/3 del modo giù dalla parte superiore della cella. Salvare il x, y, z le coordinate nella lista delle posizioni stadio salvati.
Nota: I segnali plasmidi possono non essere visibili attraverso gli oculari quando le cellule sono illuminati da LED di lunghezza d'onda appropriata per la proteina di fusione LacI. Segnali deboli possono essere visibili solo con l'uso della fotocamera EMCCD, che consente di integrare il segnale nel tempo e quindi amplifica efficacemente segnali deboli. - Nel software di controllo microscopio, definire un z-pila di immagini da eseguire in ciascuna posizione fase salvato. Scegli passo di az di 0,35-0,50 micron, che vi permetterà di approssimare campionamento di Nyquist nella dimensione z 14. Includono "extra" fette sopra e sotto i piani in cui si trovano le cellule; queste fette consentono il rilevamento seguendo movimenti delle cellule durante il ciclo cellulare, e sono utilizzati anche in post-elaborazione di acquisizione (deconvoluzione) degli stack di immagini. Tale inserimento saràprovocare una pila di 40-60 immagini, a seconda dello spessore delle celle.
- Nel software di controllo microscopio, definire un esperimento serie storica per raccogliere un'immagine luminosa campo della z-stack ad intervalli di 30 min (per il tracciamento divisioni cellulari e migrazioni su tempi lunghi) e le immagini di fluorescenza a intervalli di 10-60 min (per la visualizzazione dei plasmidi all'interno delle cellule). Non utilizzare immagini DIC durante l'esperimento, in quanto richiede più luce di standard di imaging in campo chiaro, che può esporre le cellule inutilmente fototossicità nel corso di lunghi esperimenti.
- Avviare il software controllato esperimento. Assicurare che il sistema non è disturbato (urtato, esposto alla luce ambiente eccesso, ecc) durante l'esperimento.
- Se necessario, rabboccare l'acqua nel sistema di umidificazione durante l'esperimento.
4. Post-acquisizione Elaborazione di Immagini
- Rivedere le immagini per ogni punto z-stack e tempo. Ritagliare le aree non necessarie dile immagini per ridurre il tempo di elaborazione del computer nella fase successiva.
- Utilizza un algoritmo di deconvoluzione di ri-assegnare intensità del segnale al pixel di origine in ogni z-stack 15. Mentre questo deconvoluzione può essere basato su una funzione teorica punto di diffusione per il sistema di imaging, è preferibile misurare la funzione di punto di diffusione del sistema di imaging particolare microsfere fluorescenti, e utilizzare questa misura nell'algoritmo deconvoluzione. Abbiamo misurato la funzione di diffusione del punto del nostro sistema di imaging e applicato un algoritmo di verosimiglianza vincolata iterativo massima AxioVision Software (descrizione del software AxioVision, Zeiss).
- Esaminare le immagini per registrare le variazioni di intensità e movimenti di plasmidi durante il ciclo cellulare e il partizionamento dei plasmidi a cellule figlie.
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Representative Results
Proiezioni di massima intensità di Z-stack acquisite in un esperimento rappresentativo sono mostrati nella Figura 3. Tipici segnali plasmide sono presenti in 3-8 fette di z-stack, a seconda che essi rappresentano singoli o gruppi di plasmidi. Nel caso di EBV e KSHV plasmidi derivati, i segnali muovono lentamente all'interno della cella fino alla cella raggiunge mitosi. Le cellule stesse migrano nel corso dell'esperimento. Diventano anche sferica e staccare dal piatto durante la mitosi. Il ciclo cellulare di cellule HeLa e sani SLK richiede circa 24 ore, le cellule di questi tipi che impiegano più di 30 ore per completare il ciclo cellulare dovrebbe essere considerato nocivo. Cellule figlie tipicamente allegare vicino a vicenda e andare a dividere contemporaneamente nel ciclo cella successiva. Solo le cellule che possono essere visualizzati per completare un ciclo cellulare dovrebbero essere analizzati.
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Figura 1. Schema per rendere visibile plasmidi. (A) ripetizioni in tandem della sequenza operatore lattosio (Laco) sono clonati nel plasmide di interesse. La proteina repressore lattosio (LacI) si lega specificamente a queste sequenze, la fusione di una proteina fluorescente recluta l'etichetta fluorescente al plasmide di interesse. (B e C) Il nucleo di una cellula HeLa esprime LacI-tdTomato è fluorescente a causa del segnale di localizzazione nucleare della proteina di fusione localizzazione al nucleo. Genomi KSHV codificanti sequenze Laco assumere molte copie della proteina fluorescente e spiccano come segnali luminosi sull'intensità sfondo del nucleo in assenza di IPTG (B), mentre le proteine fluorescenti LacI-viene impedito di legarsi a sua sequenza di riconoscimento in Laco la presenza di IPTG (C). Queste immagini sono computazionalmente per includere più z-aerei in cui risiedono i diversi segnali.
Figura 2. Schema del procedimento di visualizzazione plasmide. Primo, ripetizioni tandem Laco sono clonati nel plasmide di interesse. Questo plasmide viene introdotto in cellule mediante trasfezione. Cloni di cellule trasfettate sono selezionati e proiettati, e poi infettati con un retrovirus che esprime una proteina di fusione LacI fluorescente.
Figura 3. Rivedere immagini per monitorare plasmidi durante il ciclo cellulare. Etichetta fluorescente genomi virali in una cellula HeLa (A) sono sintetizzati nella fase S (B) e partizionato alle cellule figlie durante la divisione cellulare (CE) e può essere seguita per più generazioni. Mostrato sono proiezioni di massima intensità di z-stacks acquisiti di un ciclo cellulare HeLa in cinque punti temporali in un esperimento rappresentativo. Queste immagini sono fatte come in figura 1B e C.
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Discussion
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per seguire plasmidi in cellule di mammifero in diretta nel corso del tempo che attraversa più generazioni. Limitando l'esposizione alla luce di eccitazione, abbiamo usato queste tecniche per seguire le cellule da coppie di nuova divisi in colonie di 16-32 cellule, che rappresentino almeno 72 ore e 3 divisioni cellulari. Questi esperimenti forniscono informazioni che non possono essere ottenuti da test statici come la PCR quantitativa, cancellando meridionale, e FISH.
È indispensabile schermare cloni di cellule per plasmidi con struttura omogenea, come riarrangiamenti può verificarsi quando si utilizzano plasmidi con sequenze ripetitive come le ripetizioni tandem Laco. Inoltre, è utile per ottimizzare l'infezione retrovirale e cloni di cellule infette schermo ad un'intensità di segnale ottimale. Cellule che esprimono proteine troppo LacI avrà elevata fluorescenza di sfondo nel nucleo, e quelle che esprimono troppo poco avrà segnali deboli. Infine, is importante guardare morfologia cellulare e selezionare le cellule sane e tracciare i campi di vista da utilizzare durante la loro visualizzazione.
Questa tecnica può essere utilizzata per visualizzare praticamente qualsiasi molecola di DNA, a condizione che possa essere progettato con ripetizioni in tandem della sequenza Laco. Gli esempi includono cromosomi cellulari, plasmidi presenti in natura e artificiale, e genomi virali confezionati nell'ambito virioni. In esperimenti simili a quello illustrato nella figura 3, abbiamo trovato che i nostri KSHV derivati da plasmidi sembrano essere partizionato casualmente durante la divisione cellulare. Una logica estensione della tecnica è di codificare una molecola di DNA come Laco / LacI coppia con una proteina fluorescente, e un'altra molecola di DNA nella cellula come un operatore Tetracycline / Tetetracycline coppia repressore con un'altra proteina fluorescente. Gli esperimenti sono limitati dalla quantità di luce di eccitazione delle cellule può sopportare prima sperimentare effetti citotossici.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NIH e ACS, tra cui T32CA009135, CA133027, CA070723 e CA022443. Bill Sugden è una società americana di Professor Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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