Overvåking plasmidreplikasjon i Live pattedyrceller over flere generasjoner av fluorescensmikropskopi
Summary
Fremgangsmåte for å observere individuelle DNA molekyler i levende celler er beskrevet. Teknikken er basert på bindingen av en fluorescensmerket tagget lac repressor protein til bindingsseter konstruert inn i DNA av interesse. Denne metoden kan være tilpasset for å følge mange rekombinante DNA'er i levende celler over tid.
Abstract
Få naturlig forekommende plasmider er opprettholdt i pattedyrceller. Blant disse er genomene av gamma-herpesvirus, inkludert Epstein-Barr virus (EBV) og Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV), som forårsaker flere menneskelige maligniteter 1-3. Disse to genomer er kopiert i en lisensiert måte, hver med en enkelt viral protein og mobil replikering maskiner, og sendes til datter celler ved celledeling til tross for sine mangler tradisjonelle sentromerer 4-8.
Mye arbeid har blitt gjort for å karakterisere replications av disse plasmid genomer bruker metoder som blotting og fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse metodene er begrenset, skjønt. Kvantitativ PCR og Sør blotter gi informasjon om gjennomsnittlig antall plasmider per celle i en populasjon av celler. Fisk er en encellet assay som avslører både gjennomsnittlig antall og fordelingen av plasmid s per celle i bestanden av celler, men er statisk, slik at ingen informasjon om foreldre eller avkom av den undersøkte cellen.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for å visualisere plasmider i levende celler. Denne metoden er basert på bindingen av en fluorescensmerket tagget laktose repressor protein til flere steder i plasmidet av interesse 9. DNA av interesse er konstruert for å omfatte ca 250 tandem gjentar av laktose operatøren (Laco) sekvens. Laco spesifikt bundet av laktose repressor protein (laci), som kan være kondensert til en fluorescerende protein. Fusjonsproteinet kan enten uttrykt fra konstruerte plasmid eller introdusert av en retroviral vektor. På denne måten, er de DNA-molekyler fluorescensmerket tagget og derfor bli synlig via fluorescens mikroskopi. Fusjonsproteinet er blokkert fra å binde den plasmid-DNA ved å dyrke celler i nærvær av IPTG inntil plasmidene er klare for å bli sett.
ontent "> Dette systemet gjør plasmidene skal overvåkes i levende celler gjennom flere generasjoner, avslørende egenskaper deres syntese og partisjonering datter celler. Ideelle celler er tilhenger, lett transfektert, og har store kjerner. Denne teknikken har blitt brukt til å fastslå at 84% av EBV-avledet plasmider er syntetisert hver generasjon og 88% av den nylig syntetisert plasmider partisjon trofast til datter celler i HeLa celler. par av disse EBV plasmider ble sett å være bundet til eller assosiert med søsterkromatider etter deres syntese i S- fasen før de ble sett å skille som søsterkromatider separert i anaphase 10. Metoden blir nå brukt til å studere replikering av KSHV genomer i HeLa celler og SLK celler. HeLa celler udødeliggjort menneskelige epitelceller, og SLK celler foreviget human endotelial celler. Selv SLK celler ble opprinnelig stammer fra en KSHV lesjon, verken HeLa eller SLK cellelinje naturlig HarbORS KSHV genomer 11. I tillegg til å studere virusreplikasjon, kan denne visualiseringen teknikken brukes til å undersøke effektene av tilsetning, fjerning, eller mutasjon av ulike DNA sekvens elementer på syntese, lokalisering, og oppdeling av andre rekombinante plasmidkonstruksjoner DNA'er.Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som er beskrevet her kan brukes til å følge plasmider i levende pattedyrceller over tid som spenner over flere generasjoner. Ved å begrense eksponering for eksitasjon lys, har vi brukt disse teknikkene til å følge celler fra nylig delt par gjennom kolonier av 16-32 celler, som representerer minst 72 timer og 3 celledelinger. Disse eksperimentene gi informasjon som ikke kan skaffes fra statiske analyser som kvantitativ PCR, Southern blotting og fisk.
Det er viktig å skjerme klon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra NIH og ACS, inkludert T32CA009135, CA133027, CA070723, og CA022443. Bill Sugden er en American Cancer Society forsker.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
