Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung von
Abstract
Dieses Video beschreibt den Einsatz des ganzen Körpers bioluminesce Imaging (BLI) für die Untersuchung von bakteriellen Handel mit lebenden Mäusen, mit einem Schwerpunkt auf der Verwendung von Bakterien in der Gen-und Zelltherapie bei Krebs. Bakterien stellen eine attraktive Klasse von Vektor für die Krebstherapie, die über eine natürliche Fähigkeit, vorzugsweise wachsen innerhalb Tumoren nach systemischer Verabreichung. Bakterien entwickelt, um die lux Genkassette Erlaubnis BLI Nachweis der Bakterien und gleichzeitig Tumorstellen auszudrücken. Die Lage und Höhe der Bakterien innerhalb Tumoren im Laufe der Zeit leicht geprüft werden kann, visualisiert in zwei oder drei Dimensionen. Das Verfahren ist für ein breites Spektrum von Bakterien-Spezies und Tumorxenotransplantat Typen. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Analyse der Biolumineszenz Bakterien im subkutanen Tumor tragenden Mäusen. Visualisierung von symbiotischer Bakterien im Magen-Darm-Trakt (GIT) von BLI wird ebenfalls beschrieben. Diese leistungsstarke und billig, Bildgebung in Echtzeit Strategie Vertreterts eine ideale Methode zur Untersuchung von Bakterien in vivo im Kontext der Krebsforschung, insbesondere Gentherapie, und Infektionskrankheiten. Dieses Video beschreibt das Verfahren für die Untersuchung lux-markierten E. coli in lebenden Mäusen, zeigt die räumliche und zeitliche Auslesen erreichbaren Nutzung BLI mit dem IVIS System.
Protocol
Ein. Tumorinduktion
- Für die Routine Tumorinduktion wurde die minimale tumorigenen Dosis von Zellen in 200 ul serumfreiem Kulturmedium suspendiert subkutan (sc) in die Flanke frei von Infektionen 6-8 Wochen alte weibliche Balb / C oder athymischen MF1-nu/nu Mäusen injiziert n = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 6 4T1-Zellen) mit einer 21-Gauge Injektionsnadel. Die Lebensfähigkeit der Zellen zur Inokulation verwendet wurde, war größer als 95%, wie durch visuelle Zählung mit einem Hämozytometer und Trypan Blue Dye Exclusion (Gibco) bestimmt.
- Nach Tumor-Gründung, wurden Tumoren erlaubt, zu wachsen und zu entwickeln und wurden zweimal wöchentlich überwacht. Das Tumorvolumen wurde gemäß der Formel V = (ab 2) Π / 6, wobei a der längste Durchmesser des Tumors ist und b der längste Durchmesser senkrecht zu a Durchmesser berechnet.
2. Bakterielle Zubereitung
- Der Bakterienstamm in diesem Protokolls in verwendetenIch war E. coli K-12 MG1655, ein Nicht-Protein-Toxin-exprimierenden Stamm, beherbergen eine luxABCDE-codierenden Plasmid, indem die Bakterien nachgewiesen werden können BLI. E. coli MG1655 enthaltend die integrierte luxABCDE wurde aerob bei 37 ° C in LB-Medium (Sigma-Aldrich, Irland) werden mit 300 ug / ml Erythromycin (Em) ergänzt. Die Biolumineszenz Derivat des MG1655 wurde mit dem Plasmid p16S lux, welche die konstitutive P HELP luxABCDE Operon 1 enthält.
- Für die Zubereitung für die Verabreichung an Mäuse wurden die Kulturen in LB-Medium bei 37 ° C in einem Schüttler bei 200 UpM inkubiert bis zur mittleren logarithmischen Phase (optische Dichte bei 600 nm). Bakterien wurden durch Zentrifugation (6.000 × g für 5 min) gewaschen, mit PBS (Sigma), verdünnt in PBS und 1 × 10 7 koloniebildenden Einheiten (KBE) / ml für intravenöse Verabreichung oder 1 x 10 10 für Schlundsonde.
3. Bakterielle Administrationtion
- Mäuse wurden randomisiert in Versuchsgruppen eingeteilt, wenn Tumoren erreicht etwa 100 mm 3 im Volumen. Für die intravenöse Verabreichung erhalten zurückhaltende Mäusen je 10 6 Zellen in 100 ul, direkt in die laterale Schwanzvene mit einer 28G Injektionsnadel injiziert. Die Keimzahl jeder Inokulum wurde durch nachträgliche Beschichtung bestimmt.
- Für GIT Kolonisierung Studien wurden 10 9 Bakterienzellen oral in 100 ul pro Maus über eine Sonde verabreicht, an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Vorbestehenden kommensalen Bakterien-Spiegel wurden vor dem Zuführen durch Zugabe von 5 mg / ml Streptomycin in Maus Trinkwasser für 7 Tage vor dem Beginn der Schlundsonde 1 verringert.
4. Biolumineszenz-Bildgebung
- 2D in vivo Bildgebung BLI wurde unter Verwendung des IVIS100 (Bremssattel). Zu definierten Zeitpunkten nach bakteriellen Verwaltung, wurden die Mäuse betäubt mit Caliper die XGI-8 Gas AnästhesieSystem mit 3% Isofluran und Ganzkörper-Bildanalyse in der IVIS 100 für 2-5 min bei hoher Empfindlichkeit durchgeführt.
- Bei 3D-Bildgebung, wurden anästhesiert Mäusen in einem Maus-Bildgebung Shuttle Innenseite des optischen Abbildungssystem zum dorsalen Bildgebung (IVIS Spectrum, Zangenbremse) platziert. Um Bilder des bakteriellen Luciferase Signal für 3D optische Rekonstruktion erwerben wurden Emissionsfilter Wellenlängen im Bereich von 500 bis 580 nm mit bin 16 Erfassungszeiten von 3-4 min pro Filter, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Als Teil dieser Abfolge Bildaufnahme wurde ein strukturiertes Licht erhaltenen Bildes, um eine Höhe der Karte zu definieren. Diese Karte eingegeben wurde diffuse Licht bilderzeugende Tomographie (DLIT) Rekonstruktionen Algorithmen, die verwendet werden, um ein 3D Bild unter Verwendung eines optischen nichtnegative kleinsten Quadrate Optimierung 2 zu bilden waren.
- Image Analysis: Regionen von Interesse wurden identifiziert und quantifiziert mit Wohn Image Software (Caliper).
5. VertreterErgebnisse
In dieser Studie wurden die nicht-pathogenen kommensalen Bakterien E.coli K-12 MG1655 Exprimieren des luxABCDE Operon war IV Mäusen sc 4T1 Xenograft verabreicht. Bakterielle lux Signal wurde speziell in Tumoren von Mäusen nachgewiesen post IV-Verwaltung (Abbildung 2). Kultur von Bakterien aus Erholung Probe Mäusen validiert die Existenz eines linearen Zusammenhangs zwischen lebensfähigen Bakterienzahl und der Lichtmenge erfasst wird (Abbildung 3). In vivo Bildgebung von oral verabreichten kommensalen Bakterien im GIT wird auch unter Verwendung von 3D BLI.
Abbildung 1. Protokoll Timeline. Subkutanen Tumoren in Mäusen induziert und Bakterien auf Tumor-Entwicklung (100 mm 3) verabreicht wird. Live-Mäuse sind BLI imAlter an verschiedenen Zeitpunkten nach bakteriellen Verwaltung (Pfeile zeigen typische mal).
Abbildung 2. Verwaltung von E. coli MG1655 luxABCDE um tumortragenden Mäusen. Subkutane 4T1 Tumoren wurden in MF1 nu / nu Mäusen und E. induzierte coli MG1655 luxABCDE auf Tumor-Entwicklung verwaltet. Jedes Tier erhielt 10 6 Zellen direkt in die laterale Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden zu vier Zeitpunkten während der Studie (schwarze Punkte z-Achse und Bilder) mit anschließender Wiederherstellung lebensfähiger Bakterien (cfu) aus Tumoren von Probe geopfert Mäusen (Balkendiagramm) abgebildet wird. Erhöhung der Keimzahlen und Plasmid-Genexpression spezifisch in Tumoren wurde im Laufe der Zeit (Vertreter Maus pro Zeitpunkt dargestellt) beobachtet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Relationship Between Intratumorale Bakterienzahl und Biolumineszenz. Lebensfähigen Bakterien in Tumoren wurden durch ex vivo Bakterienkultur von Tumoren im Anschluss an BLI an verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Verabreichung aufgezählt. Anmelden Werte Keimzahlen (KBE) in Bezug auf in vivo bioluminesce Einheiten werden grafisch dargestellt. Eine robuste Korrelation zwischen Keimzahlen und bakteriellen Biolumineszenz-Signale beobachtet R 2 = 0,9717 ein.
Abbildung 4. 3D IVIS Image Of Murine Gastrointestinal Tract kolonisiert von E. coli MG1655. Das GIT von Mäusen wurde durch orale Verabreichung von 10 9 cfu E. kolonisiert coli an drei aufeinanderfolgenden Tagen. Eine Probe isoliert Bild von 3D-Tomographie des kolonisierten Maus gezeigt.3D-Bilder zeigen eine digitale Maus atlas des Skeletts an anatomische Registrierung ein. E. coli MG1655 Biolumineszenz ist sichtbar in grün bei niedrigeren und lila auf höheren Ebenen.
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Discussion
Im Rahmen der Gentherapie hat sich die Verwendung von biologischen Agenzien zur Abgabe von therapeutischen Genen für Patienten sehr vielversprechend 3-5 gezeigt. Wie Viren erlauben die angeborenen biologischen Eigenschaften von Bakterien effizienten DNA-Abgabe an Zellen oder Gewebe, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen. Es hat sich gezeigt, daß Bakterien in der Lage sind natürlich Homing auf Tumoren, wenn systemisch verabreicht, was zu hohen Replikation lokal entweder außerhalb (nicht-invasive Arten) oder innerhalb Tumorzellen (Krankheitserreger). Krebs-spezifische bakterielle Replikation wurde zunächst auf die hypoxische Natur von soliden Tumoren (low O 2 Ebenen) zugeschrieben, mit dem anaeroben Natur hypoxischen / nekrotischen Regionen innerhalb Tumoren Förderung des Wachstums von anaeroben und fakultativ anaerobe Bakterien. In jüngerer Zeit sind Faktoren, wie der unregelmäßigen, undichte Blutversorgung und lokale Immunsuppression in Tumoren vorgeschlagen worden, eine Rolle spielen. Die meisten präklinischen Studien xenogr genutztachtern Tumormodellen zu untersuchen bakteriellen Vektor Tumor Kolonisation. Mausmodellen von spontan auftretenden Tumoren stärker ähneln klinischen Realität im Sinne Gefäßsystem (potentieller Variable in bakterielle Besiedelung von Tumoren), und Bakterien haben auch gezeigt, dass solche Modelle 6 kolonisieren. Verschiedene präklinische und klinische Studien haben die Fähigkeit verschiedener Bakterienstämme zu transportieren und zu verstärken Genen kodiert Faktoren wie Prodrug-Converting-Enzyme, Toxine, Angiogenese-Inhibitoren, und Zytokine gezielt in Tumoren 4,7 dargestellt. Während bakterielle Besiedelung Tumor nachgewiesen wurde als unabhängig von Bakterienstamm und Tumortyp 6 kann die Auswahl der optimalen Belastung für ein bestimmtes Modell variieren - zB obligate Anaerobier geeigneter sein für große nekrotischen Tumoren.
Wir haben eine Reihe von Stämmen entwickelt, um auszudrücken das luxABCDE Kassette 1,8-11. Das Protokoll in dem Video umrissenAnimation verwendet lux-markierten E. coli als ein Beispiel. E. coli ist Teil der Flora des menschlichen GIT. Mehrere Studien haben die Sicherheit von intravenöser Verabreichung von nicht-pathogenen E. umrissen coli-Stämme an Mäuse und ihrer Fähigkeit, spezifisch wachsen innerhalb Tumoren 4,12. E. coli MG1655 (wie in dieser Studie verwendet) besiedelt die Maus auch GIT zu hohen 13.
Das Studium der Bakterien in kleinen Tiermodellen ist von hoher Bedeutung für eine Reihe von medizinischen Forschungsbereichen, darunter Infektionskrankheiten, Darmgesundheit und Gentherapie. Beispielsweise Anpassungen dieses Protokolls können für Untersuchungen von bakteriellen Infektion Tracking haben Biofilmbildung etc. Andere genbasierte Reportersysteme ebenfalls untersucht, einschließlich Positron Emission Topographie (PET)-Scanning in Kombination mit bakteriellen Expression von Thymidin-Kinase (tk ), es endogene Expression in E. sein coli oder S. Typhimurium engineered den tk Gen aus Herpes Simplex Virus (HSVtk) 14 abzugeben. Beide fluoreszierend (Green Fluorescent Protein und ihre Varianten) und Leuchtstoffe (lux) Gene sind für Bakterien. Ein Vorteil der Verwendung bakterieller Luciferase ist, dass die lux-Kassette für die Enzyme erforderlich Substrat Biosynthese codiert, was zu einer direkt abbildbaren Mittel 15. BLI beruht auf dem Nachweis des biolumineszierenden Lichts von dem Subjekt durch die Verwendung einer gekühlten basierend charged coupled device (CCD)-Kamera. Die relativ einfache Instrumentierung und mangelnde Anforderung für Radioaktivität stellt die Technologie gut innerhalb der Reichweite des durchschnittlichen Labor. BLI zeigt viele Vorteile, wenn sie mit anderen in vivo-Verfahren verglichen. Es ist leicht zu bedienen, preiswert, schnell und erleichtert die Bildgebung von mehreren Tieren gleichzeitig, wodurch wenig Hintergrund mit hoher Empfindlichkeit.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Unterstützung in bezug auf dieses Manuskript von der Europäischen Kommission Siebten Rahmenprogramms (PIOF-GA-2009 bis 255.466) und dem Irish Health Research Board (HRA_POR/2010/138) quittieren. Lux-markierten E. coli war eine Art Geschenk von Dr. Cormac Gahan, University College Cork.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
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