Summary
Bu makale idaresi anlatılmaktadır
Abstract
Bu video kanseri için gen ve hücre tedavisi bakterilerin kullanımı ile ilgili bir vurgu ile, canlı farelerde bakteriyel ticareti çalışma için tüm vücut bioluminesce görüntüleme (BLI) kullanımı anlatılmaktadır. Bakteriler sistemik uygulamayı takiben tümörler içinde tercihen büyümek için doğal bir yeteneği sahip, kanser tedavisi için vektör çekici bir sınıf mevcut. Bakteriler bakteri ve aynı zamanda tümörün sitelerin lux gen kasetinin izni BLI algılama ifade için tasarlanmıştır. Zaman içinde tümörler içinde yer ve bakteri düzeylerini kolayca kontrol edilebilir, iki ya da üç boyutlu olarak gözlemlenmiştir. Yöntem bakteri türleri ve tümör ksenogreft türleri geniş bir aralığı için geçerlidir. Bu makale, subkutan tümör taşıyan fareler içinde biyolüminesans bakteri analizi için protokol açıklanmaktadır. BLI ile gastrointestinal sistem (GIT) içinde bakterilere görselleştirilmesi de tarif edilmektedir. Bu güçlü ve ucuz, gerçek zamanlı görüntüleme stratejisi temsilcisits belirli kanser, özellikle gen tedavisi araştırma, ve enfeksiyöz hastalık bağlamında in vivo bakteri çalışma için ideal bir yöntem. Bu video lux-etiketli E. incelemek için prosedür ana hatlarıyla IVIS sistemi ile mekansal ve zamansal okuma başarılabilir kullanan BLI gösteren canlı farelerde coli.
Protocol
1. Tümör İndüksiyon
- Rutin tümör indüksiyon için, serum içermeyen kültür ortamı 200 ul içinde süspansiye edilmiş hücreler asgari tümörojenik doz serbest enfeksiyonun yan 6-8 haftalık dişi Balb / C veya atimik fareler içine MF1-nu/nu (sc) deri altından enjekte edilmiştir n 21-gauge enjektör iğnesi kullanarak = 6 (Harlan, Oxfordshire, UK) (1 x 10 6 4T1 hücreleri). Bir haemocytometer ve tripan mavi boyasıyla çıkarma (Gibco) kullanılarak görsel sayımı ile belirlenir olarak aşılama için kullanılan hücre canlılığı% 95'ten daha fazla idi.
- Tümör kurulmasının ardından, tümörleri büyümeye ve gelişmeye izin verildi ve iki haftalık takip edildi. Tümör hacmi tümörün en uzun çapı ve b çapı için en uzun çapı dik olan ve formül V = (ab 2) Π / 6, göre hesaplanmıştır.
2. Bakteriyel Hazırlık
- Bu protoco kullanılan bakteri suşul E. oldu coli K-12 MG1655, non-protein-toksin salgılayan bakterileri tarafından tespit edilmesini sağlar bir luxABCDE kodlama plazmid barındıran, zorlanma BLI. E. Entegre luxABCDE içeren coli MG1655, 37 aerobik olarak yetiştirilen ° C LB ortamı (Sigma-Aldrich, İrlanda) 300 ug / ml eritromisin (Em) ile desteklenmiştir. MG1655 ve bioluminescent türevi plazmid p16S lux bünye P YARDIM luxABCDE operon 1 içeren kullanılarak oluşturuldu.
- Fareler için uygulama için hazırlanması için, kültürler orta log fazı (600 nm'de optik yoğunluk) 200 rpm'de bir çalkalama kabında 37 ° C'de LB ortamı içinde inkübe edildi. Bakteriler, (6000 x g 5 dakika) santrifüj ile toplanır, PBS (Sigma) ile yıkanmış ve PBS içinde seyreltilmiş ve 1 x 10 7 koloni oluşturan birim (CFU) / intravenöz için mL, ya da gavaj için 1 x 10 10.
3. Bakteriyel Dairesition
- Tümör hacmi yaklaşık 100 mm 3 ulaştığı zaman fareler rasgele deney grubuna ayrıldı. Intravenöz için, ölçülü fareler her bir 28G şırınga iğnesi kullanarak lateral kuyruk ven içine doğrudan enjekte 100 ul 10 6 hücre aldı. Her bir inokulum canlı sayımı geriye dönük kaplama ile tespit edilmiştir.
- GYTE kolonizasyon çalışmaları için 10 9 bakteri hücrelerinin oral üç gün üst üste, gavaj yoluyla fare başına 100 ul uygulanmıştır. Önceden mevcut komensal bakteri seviyeleri önce ağızdan sonda 1 başlamasından 7 gün için fare içme suyu içinde 5 mg / ml streptomisin ilavesiyle besleme önce düşürülmüştür.
4. Biyoparlaklık Görüntüleme
- In vivo BLI görüntüleme 2B IVIS100 (Kaliper) kullanılarak yapıldı. Tanımlanmış zaman noktalarında sonrası bakteriyel yönetimi olarak, farelerin Kaliper en XGI-8 Gaz Anestezi kullanarak uyutulduktan% 3 Isofluorane, ve tüm-vücut görüntü analiz sistemi ile yüksek duyarlılık 2-5 dakika boyunca sistem 100 IVIS uygulandı.
- 3D görüntüleme için, anestezi fareler dorsal görüntüleme için optik görüntüleme sistemi (IVIS Spektrum, kaliper) içinde bir fare görüntüleme servis yerleştirildi. 3D optik rekonstrüksiyon için bakteriyel lusiferaz sinyalinin görüntü elde etmek için, 500-580 nm arasında değişen emisyon filtresi dalga gürültü oranı sinyali maksimize etmek için filtre başına 3-4 dk bin 16 edinimi kez kullanılmıştır. Bu görüntü elde etme sırası bir parçası olarak, yapılandırılmış bir ışık görüntü yükseklik haritası tanımlamak için elde edilmiştir. Bu harita giriş diffüz ışık görüntüleme tomografi (DLIT) negatif olmayan en küçük kareler optimizasyon 2 kullanarak bir 3D optik görüntü oluşturmak için kullanılan rekonstrüksiyon algoritmaları oldu.
- Görüntü Analizi: ilgi bölgeler belirlenmeli ve Yaşam Image yazılımı (Kaliper) kullanılarak ölçüldü.
5. TemsilciSonuçlar
Bu çalışmada, patojenik olmayan ortakçı bakteri E.coli K-12 MG1655 luxABCDE operon ifade IV sc 4T1 ksenogreft tümörleri taşıyan farelere uygulandığında oldu. Bakteriyel lux sinyalinin farelerde tümörlerin özellikle saptandı sonrası IV-yönetim (Şekil 2). Örnek fareler elde edilen bakteri kültürü iyileşme uygun bakteri sayısı ve tespit ışık miktarı (Şekil 3) arasında doğrusal bir ilişki varlığını doğrular. GIT içinde oral olarak uygulandığında, bakterilere ve in vivo olarak da 3D BLI kullanılarak elde edilir.
Şekil 1. Protokol Timeline. Subkutan tümörler farelerde indüklenen ve bakteriler tümör gelişimi (100 mm 3) üzerine uygulanır. Canlı fareler BLI im vardırçeşitli zaman noktalarında sonrası bakteriyel idaresi (oklar tipik kez gösterilecek) de yaş.
Şekil 2. E. İdaresi Tümör taşıyan fareler için coli MG1655 luxABCDE. Subkutan 4T1 tümörlerin MF1 nu / nu farelerine ve E'de indüklenen edildi coli MG1655 luxABCDE tümör gelişimi üzerine uygulanmıştır. Her hayvan lateral kuyruk ven içine doğrudan enjekte 10 6 hücre aldı. Fare örnek kurban farelerde tümör canlı bakteri sonraki kurtarma (cfu) ile çalışma sırasında dört zaman noktalarında (siyah noktalar z ekseni ve görüntüler) (çubuk grafik) de görüntülendi. Bakteriyel numaraları ve özellikle tümörlerde zaman (temsilcisi fare zaman noktası başına resimli) üzerinde saptandı plazmid gen ekspresyonu artış. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. İntratümöral Bakteriyel Numaraları Ve Biyoparlaklık Arasındaki İlişki. Canlı bakteri tümörleri çeşitli zaman noktalarında sonrası intravenöz az BLI izleyen tümörlerden ex vivo bakteriyel kültür tarafından numaralandırılan. In vivo bioluminesce birimleri göre bakteri sayı değerleri (cfu), oturum grafikle edilir. Bakteri sayımı ve bakteriyel biyolüminesans sinyalleri arasında sağlam bir ilişki gözlenmektedir R 2 = 0,9717 1.
Şekil 4. Mürin gastrointestinal 3D IVIS Görüntü E. tarafından kolonileştirildiğini coli MG1655. farelerin GYTE E. 10 9 cfu oral tarafından kolonize edildi üç gün üst üste coli. Kolonize fare 3D tomografi alınan bir numuneden izole görüntü gösterilir.3 boyutlu görüntüler anatomik kayıt sağlanmasında iskeletin bir dijital fare atlası göstermektedir. E. coli MG1655 biyolüminesans düşük yeşil görünür, ve yüksek düzeyde mor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen terapi bağlamında, hasta için terapötik gen ulaştırılması için biyolojik ajanların kullanımı büyük söz 3-5 göstermiştir. Gibi virüsler, bakteriler ve doğal biyolojik özelliklerini, özellikle kanser bağlamında, hücreler ya da dokulara etkili DNA aktarma izin verir. Bakterilerin doğal olarak yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir için sistemik olarak ya da lokal olarak replikasyon dış, yüksek düzeyde (invazif olmayan türler) ya da tümör hücreleri (patojen) içinde idare edilen tümörler için yuvalandırma. Kanser spesifik bakteriyel replikasyon başlangıçta anaerobik ve fakültatif anaerobik bakterilerin büyümesini teşvik tümörler içinde hipoksik / nekrotik bölgelerin anaerobik doğa ile, solid tümörlerin hipoksik doğası (düşük O 2 düzeyi) bağlandı. Daha yakın zamanlarda, örneğin düzensiz, sızdıran kan temini ve tümörlerde lokal bağışıklık baskılanması gibi faktörlerin rol oynadığı öne sürülmektedir. En preklinik çalışmalar xenogr faydalanmışKıç tümör modelleri bakteriyel vektör tümörün varlığını araştırdık. Kendiliğinden gelişen tümörlerin sıçan modellerinde daha yakından damarlarda (tümörlerin bakteriyel kolonizasyonu potansiyel bir değişken) açısından klinik gerçeğe benzer ve bakteriler de bu tür modeller 6 kolonize olduğu gösterilmiştir. Çeşitli klinik öncesi ve klinik denemeler gibi proilacı dönüştürücü enzim, toksinler, anjiyogenez inhibitörleri ve özellikle tümör 4,7 olan sitokinler gibi genlerin kodlama faktörler taşımak ve yükseltmek için farklı bakteri suşlarının yeteneğini göstermiştir. Bakteriyel tümör kolonizasyon bakterinin ve tümör tipinin 6 bağımsız olduğu gösterilmiş olsa da, belirli bir model için optimum gerginlik seçimi değişebilir - örneğin katı anaeroblar büyük nekrotik tümörler için daha uygun olabilir.
Biz luxABCDE kaseti 1,8-11 ifade suş tasarladık. Video özetlenen protokolüanimasyon lux etiketli E. kullanır Bir örnek olarak coli. E. coli insan GYTE florasının bir parçasıdır. Çeşitli çalışmalarda patojen olmayan E. intravenöz güvenliği özetlediğim coli farelere suşları ve tümörler 4,12 içinde özellikle büyümeye yeteneği. E. coli MG1655 (bu çalışmada kullanılan) da yüksek seviyelerde 13 fare GYTE kolonize.
Küçük hayvan modellerinde bakteri çalışmada tıbbi araştırma alanlarında bir dizi yüksek öneme sahiptir; bulaşıcı hastalıklar, bağırsak sağlığını ve gen tedavisi de dahil olmak üzere. Örneğin, bu protokolün uyarlamaları bakteriyel enfeksiyon izleme çalışmaları için de geçerli olabilir, biyofilm oluşumu vb Diğer gen tabanlı muhabiri sistemleri de timidin kinaz bakteriyel ifadesi ile birlikte tarama Pozitron Emisyon Topografyası (PET) (tk dahil incelenmiş ), E. içinde endojen ifadesi coli veya S. Typhimurium engineered Herpes Simplex Virüsü (HSVtk) 14 tk geni ifade etmek. Floresan (Yeşil floresan proteini ve türevleri) ve parlak (lux) genleri iki bakteri için kullanılabilir. Bakteriyel lusiferaz kullanmanın avantajı, lux kaset bir direkt olarak imagable ajanı 15 ile sonuçlanan, alt tabaka biyosentezi için gerekli enzimleri kodlayan olmasıdır. BLI bir soğutmalı kullanımı yoluyla konudan bioluminescent ışık algılama dayanan Coupled Device (CCD) kamera ücret. Nispeten basit enstrümantasyon ve radyoaktivite ihtiyacının eksikliği de ortalama laboratuvar ulaşılabilecek teknoloji koyar. In vivo yöntemler diğer karşılaştırıldığında BLI birçok faydalar görüntüler. Bu, kullanımı kolay, ucuz, hızlı ve yüksek hassasiyet ile biraz arka plan üreten, aynı anda birden fazla hayvan görüntüleme kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı (PIOF-GA-2009-255466) ve İrlanda Sağlık Araştırma Kurulu'nun (HRA_POR/2010/138) Bu yazının ilgili destek kabul etmek istiyoruz. Lux etiketli E. coli Dr Cormac Gahan, University College Cork bir tür hediye oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | ATCC | CRL-2539 | Syngeneic breast cancer model derived from a spontaneously arising BALB/c mammary tumor |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline |
| Xenogen IVIS | Caliper Life Sciences | IVIS 100 for 2D imaging; IVIS Spectrum for 3D. | |
| Luria Broth Miller (LB) | Sigma-Aldrich | L2542 | Growth medium for E. coli |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | Antibiotic |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S9137 | Antibiotic |
| MF1nu/nu mice | Harlan (UK) | 069(nu)/070(nu/+) | Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu |
| Balb/c mice | Harlan (UK) | 066 | Haplotype:H-2d |
| Gavage needle | Vet-tech Solutions (UK) | DE009 | 22G x 38mm straight gavage needle |
| Syringe for IV injection | BD BioSciences | 309309 - 1 ml | Insulin syringe with 28 G x ½ inch micro-fine IV needle. |
| Syringe for tumor inoculation | Braun | 9161376V | Omnifix 26 G x ½ inch needle |
References
- Cronin, M., et al. High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting. PLoS One. 7, e30940 (2012).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).
- Tangney, M., Ahmad, S., Collins, S. A., O'Sullivan, G. C. Gene therapy for prostate cancer. Postgrad Med. 122, 166-180 (2010).
- Morrissey, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Tumour targeting with systemically administered bacteria. Curr. Gene Ther. 10, 3-14 (2010).
- Collins, S. A., et al. Viral vectors in cancer immunotherapy: which vector for which strategy. Curr. Gene Ther. 8, 66-78 (2008).
- Yu, Y. A., Zhang, Q., Szalay, A. A. Establishment and characterization of conditions required for tumor colonization by intravenously delivered bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 567-578 (2008).
- Baban, C. K., Cronin, M., O'Hanlon, D., O'Sullivan, G. C., Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer. Bioeng. Bugs. 1, 385-394 (2010).
- Cronin, M., et al. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol. Ther. 18, 1397-1407 (2010).
- van Pijkeren, J. P., et al. A novel Listeria monocytogenes-based DNA delivery system for cancer gene therapy. Hum. Gene Ther. 21, 405-416 (2010).
- Ahmad, S., et al. Induction of effective antitumor response after mucosal bacterial vector mediated DNA vaccination with endogenous prostate cancer specific antigen. J. Urol. 186, 687-693 (2011).
- Riedel, C. U., et al. Improved luciferase tagging system for Listeria monocytogenes allows real-time monitoring in vivo and in vitro. Appl Environ Microbiol. 73, 3091-3094 (2007).
- Cheng, C. M., et al. Tumor-targeting prodrug-activating bacteria for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 15, 393-401 (2008).
- Foucault, M. L., Thomas, L., Goussard, S., Branchini, B. R., Grillot-Courvalin, C. In vivo bioluminescence imaging for the study of intestinal colonization by Escherichia coli in mice. Appl. Environ. Microbiol. 76, 264-274 (2010).
- Collins, S. A., Hiraoka, K., Inagaki, A., Kasahara, N., Tangney, M. PET Imaging For Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
- Tangney, M., Francis, K. P. In vivo Optical Imaging in Gene & Cell Therapy. Curr. Gene Ther. , (2012).
