Summary
우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.
Abstract
지난 수년 동안 폐의 면역 규제의 다양한 측면에 대한 폐포 타입 II 상피 세포 (AECII)의 후원금이 점차 인정 받고 있습니다. AECII는 염증 항공의 시토 킨 생산에 참여하고 감염 및 T-세포 매개 autoimmunity 1-8 모두에서 세포를 항원 제시로도 역할을 표시하고 있습니다. 따라서, 그들은 그러한에게기도 하이퍼 반응 등 임상 상황에서도 특별히 흥미있는 외국인뿐만 아니라 자기 항원 직접 또는 간접적 AECII을 타겟팅 감염. 그러나, 건강한 폐뿐만 아니라 염증의 폐포 타입 II 상피 세포에 의해 제공 자세한 immunologic 기능에 대한 우리의 이해는 단편 남아 있습니다. AECII 기능에 관한 많은 연구가 9-12 마우스 또는 인간의 폐포 상피 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 세포 라인과 함께 일하는 것은 확실히 같은 많은 수의 가용성 O와 같은 혜택을 제공합니다광범위한 분석을위한 F 세포. 그러나, 우리는 기본 손쥐 AECII의 사용이 감염이나 면역 염증과 같은 복잡한 과정이 세포 유형의 역할에 대한 이해를 갖게 될 것입니다. 기본 손쥐 AECII들은 분석 설정에서 역할을 모두 추가 외부 요인에 따라되었습니다 즉, 같은 호흡기 질환을 앓고있는 동물에서 직접 분리 할 수 있습니다. 예를 들어, 가능한 AECII은 intranasally 주로 복제 13이 세포를 대상으로 인플루엔자 바이러스에 감염된 생쥐에서 분리 할 수 있습니다. 중요한 것은, 건강한 쥐에서 분리 AECII의 전 생체 감염을 통해 감염에 장착 된 세포 반응의 연구는 더욱 확장 할 수 있습니다.
주요 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은, CD11c, CD11b, F4/80에 대한 특정 항체로 인한 세포 현탁액의 라벨 다음에 마우스 폐의 효소 소화에 기초CD19, CD45 및 CD16/CD32. 세분화 된 AECII 그 다음 높은 라벨과 측면의 분산 (SSC 높은) 세포 인구로 식별되며 3 분류 형광 활성 세포로 구분됩니다.
마우스 폐에서 기본 상피 세포를 분리하는 다른 방법에 비해, 부정적인 선택에 의해 AECII의 흐름 cytometric 절연을위한 프로토콜은 비교적 짧은 시간에 손길이 닿지 않은, 매우 실용적 순수 AECII를 얻을. 또한, 및 패닝과 림프구의 고갈에 의한 절연이 기존의 방법과는 달리 항체 - 커플 링 자석 구슬 14, 15의 바인딩을 통해, 흐름 cytometric 셀 정렬은 셀 크기와 세분화에 의해 차별을 할 수 있습니다. 흐름 cytometric 셀 정렬을위한 장비를 사용할 수 있는지 감안할 때, 설명 절차는 상대적으로 낮은 비용으로 적용 할 수 있습니다. 표준 항체 및 폐 붕괴에 대한 효소 등 자기와 같은 별도의 시약 옆에구슬이 필요합니다. 절연 세포가 체외 문화와 T-세포 자극의 assays에서뿐만 아니라 transcriptome, 프로테옴 또는 secretome 분석 3, 4 등이 포함 기능 및 분자 연구, 다양한 적합합니다.
Protocol
필요한 시약 및 재료에 관한 자세한 내용은 아래의 프로토콜의 끝 부분에 다음 표에 나열되어 있습니다. 작업을 시작하기 전에, 4 dispase의 ML과 ° C 물 목욕에 37 미리 따뜻하게을 포함하는 15 ML 튜브를 (마우스 하나씩)을 준비합니다. 가열 블록에서 곧 95-1% 낮은 용해 아가로 오스 (물)의 작은 aliquots를 가열 ° C 액화 때까지 사용 할 때까지 45 ° C에이어서 좋아.
1. 마우스 폐의 작성
- CO 2 질식하여 마우스를 희생. 참고 : 성공적으로 수행 될 수 없습니다와 같은 액체와 폐의 설치로, 프로토콜의 단계를 수행하므로이 기관을 손상하므로 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오. nociceptive 반사 손실을 보장합니다.
- 에탄올로 마우스를 뿌려서 몸의 복부 중간 선을 따라 긴 몫을합니다. 복부 털과 피부를 당겨하고 이후도 조심스럽게 잘라 복막을 제거합니다.
- 을 ...에게서 피를 뽑다왼쪽과 오른쪽 경정맥 정맥 (베나 jugularis)뿐만 아니라 신장 동맥 (Arteria renalis)를 절단하여 마우스. 조직과 흐르는 혈액을 제거합니다.
- 조심스럽게 다음 찔린하고 늑골을 멀리 절단하여 마음과 폐를 노출 할 수있는 피임기구를 제거합니다. 폐를 손상하지 특별히 조심하고.
- 추위 인산로 가득 26G 캐뉼라와 10 ML의 주사기로 생리 (PBS), 찔린 심장의 우심실은 버퍼와 혈액의 무료까지 PBS로 폐를 perfuse.
- 기관을 폭로 할 수있는 침샘을 잘라 제거합니다. 또한주의 깊게 호흡 관을 둘러싼 근육을 잘라.
- 기관에 22G 내주하시는의 캐뉼라를 삽입하고, 바늘을 제거하고 폐에 대한 플라스틱 카테터를 밀어. 기관 및 카테터 주변 원사의 작은 조각을 매는하여 카테터를 해결했습니다.
2. 폐 조직의 효소 소화
원하는 경우, bronchoalveolar 세척 유체 샘플 수다음 단계 전에 PBS 또는 매체 기관에 삽입 된 카테터를 통해 폐를 플러싱으로 준비했습니다.
- 2 ML의 주사기를 사용하여주의 깊게 모든 엽이 완전히 확장되도록 카테터를 통해 폐에 dispase 2 ML (4 ML의 나누어지는에서)의 최대 볼륨을 심어. 액화 아가로 오스의 0.5 ML를 포함하는 1 ML의 주사기와 주사기를 교환하고 또한 폐에 심어.
- 아가로 오스의 다시 흐름을 방지하고 즉시 실험실 티슈과 얼음으로 폐를 커버 할 수있는 카테 테르에 주사기를 둡니다. 몇 분의 아가로 오스 젤을 보자.
- , 휴지, 얼음, 주사기와 카테터를 제거 기관 및 소비세 폐, 심장과 가슴에서 thymus을 잘라. 그런 다음 PBS와 접시에 폐를 씻어 심장, thymus와 나머지 기관을 제거합니다.
- dispase의 나머지 두 ML에 폐를 넣고 45 분 동안 실온에서 알을 품다.
3. 폐의 작성세포 현탁액
- dispase에서 폐를 제거하고 DMEM 매체 100 μl DNase에 anti-CD16/32 항체의 7 ML (1 μg / ML 최종 농도)를 포함하는 요리로 전송.
- 집게를 사용하여 완전히 떨어져 당겨 폐 조직을 분해하고 부드럽게 200 RPM으로 설정 로커에 흔들 동안 실온에서 10 분에 품다. 원하는 경우, 세포 현탁액은 다음 단계까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 100 μm와 이후 70 μm, 48 μm 및 30 μm 구멍이있는 첫번째 나일론 meshes를 통해 세포 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 세포의 손실을 최소화하고 수익을 극대화 할뿐만 아니라 DMEM으로 튜브 철저히 요리 각 메쉬를 씻어하는데주의를 기울여야. 당신이 샘플을 풀링하는 경우, 이것은 이후 같은 필터를 통해 한 그룹의 쥐에서 세포 현탁액을 통과하여 여기에 달성 될 수있다. 막힘의 경우 필터를 갱신.
- 볼륨에 따라 하나 이상의 50 ML 튜브로 여과를 전송하고160 XG에서 15 분, 4 ° C.에 대해 원심 분리기 표면에 뜨는을 제거합니다.
- 2 ML 적혈구 용해 완충액 (0.15 M NH 4 망할 CIA, 0.01 M KHCO 3, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 세포 펠렛을 Resuspend 빠르게 DMEM 매체 13 ML의 추가에 의해 용해을 해지 할 수 있습니다. 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송
4. 흐름 Cytometric 셀 정렬에 대한 항체 염색법
- 유동 세포 계측법에 적합한 dilutions에 DMEM 매체에 준비 3 ML 기본 항체 칵테일에 세포를 Resuspend. (항체는 이전에 100 μl의 볼륨에 1 개 10 6 splenocytes 얼룩으로 최적의 작업 dilutions을 위해 titrated되었습니다. 사용 다섯 마우스까지에서 풀링 된 세포에 대한 사용 항체 각각에 대한 최적의 농도를 포함하는 차 항체 칵테일 3 ML. 더 많은 생쥐가 하나 샘플로 풀링하는 경우)의 볼륨을 조정합니다.
- 착색를 들어, 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 배양4 번 ° C.
- 12 160 XG에서 분, 4 DMEM 매체와 원심 분리와 함께 15 ML 튜브를 작성하여 세포를 씻으 ° C.
- 경우 uncoupled 또는 biotinylated 항체는 4.1에 사용되었습니다 표면에 뜨는을 제거하고 2 세포를 resuspend - 3 ML 보조 항체 칵테일. 어둠 속에서 4에 10 분 ° C에 청바지.
- 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 DMEM과 원심 분리로 관을 작성을 통해 세포를 씻으십시오
- 셀 - 정렬의 튜브에 필터 50 μm을 통해 DMEM 및 사전 필터의 1 ML에있는 세포를 Resuspend. 선택 사항 : 폐 세포 현탁액의 전체 전화 번호를 얻기 위해 셀을 계산합니다.
5. 셀 - 정렬
- 정렬하기 전에 vortexing하여 세포를 섞는다. AECII의 세포 분류에 100 μm의 노즐을 사용합니다. 칼집 유체 압력뿐만 아니라 레이저 방출 및 검출 파장은 흐름 cytometric 셀 정렬뿐만 아니라 antib에 사용 된 fluorochromes에 사용되는 악기에 따라 달라집니다ody 착색 절차.
- DMEM을 포함하는 관으로 착색 및 정렬에 사용되는 fluorochromes에 대한 부정적인있는 SSC 높은 세포에서 게이트. (SSC-A) 창 (에 게이팅 전략의 세부 정보를 확인하는 doublets 또는 셀을 합산에서 제외하는 분산 형 높이 (FSC-H) 대 면적 (FSC-A)와 옆으로의 분산 높이 (SSC-H) 대 면적 앞으로 사용 1)을 그림.
- 20 280 XG에서 분, 4 정렬 셀 원심 분리기를 수집하기 위해 ° C.
- 후속 분석을 위해 필요한 문화 중간이나 버퍼에있는 셀을 Resuspend.
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Representative Results
건강한 쥐에서 분리 폐 세포 현탁액을 정렬하면 AECII 게이트는 일반적으로 42 정도 차지합니다 ± 모든 이벤트의 10 %입니다. 이 비율은 초기 세포 현탁액은기도에 채용 림프구와 기타 면역 세포의 상당히 높은 비율을 포함하므로, 이러한 바이러스 감염과 같은 호흡기 조건에 마우스를 사용하는 경우 현저하게 낮을 수 있습니다. 3 일 다음과 같은 감염에 IAV 감염된 폐 격리 AECII 위해 우리는 약 50 % AECII 게이트의 셀의 빈도의 감소를 관찰했습니다.
정렬 셀의 전형적인 종류뿐만 아니라 재 분석은 그림 1 B와 1 C로 그려져 있습니다. 표시된 바와 같이, 절연 세포의 순도는 약 92 계정 ± 5 %입니다. 그림 2A에서 우리는 순수한 세포 인구의 성공적인 분리에 의해 독점적으로 표현된다 계면 활성제 - 단백질 C,에 얼룩으로 확인 할 수 있습니다 보여AECII 16, 17.
우리는 하나의 동물 당 고립 AECII의 숫자가 강력하게 사용하는 마우스 변형에 따라 달라집니다 것을 관찰했다. BALB / C 마우스는 일반적으로 1 X 10를 얻을 반면 6 AECII / 마우스, C57Bl / 6 변형 만 수율 1-3 × 10 5 AECII / 마우스. 실험 당 사용되는 마우스의 수는 따라서 마우스 변형뿐만 아니라 수행 할 후속 분석의 종류에 따라 다릅니다.
검색 AECII의 생존 능력에 관해서는, 우리는 일반적으로 흐름 cytometric 셀 정렬에 따라 90 %의 생존 요금을 찾으십시오. 가능한 세포의 비율이 높다고는 직접 기능 분석뿐만 아니라 절연 주요 손쥐 AECII의 단기 문화를 할 수 있습니다.
1 그림. 개요 O버전 부정적인 선택하여 기본 손쥐 AECII의 흐름 cytometric 분리에 사용되는 게이팅 전략. 게이팅 전략 이상 (A) 개략도. (B) 폐 세포 현탁액 정렬 대표 플롯. (C) 정렬 세포의 재 분석의 대표 결과는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 특성화 및 정렬 기본 손쥐 AECII의 분자 분석. (A) 정렬 AECII의 Cytospins은 계면 활성제 단백질 C (SPC)에 얼룩이되었습니다. 위상 콘트라스트 현미경에 비해 세포의 거의 100 %가 SPC는 긍정적 인 것으로 밝혀졌다. RNA-분리 한 후 정렬 기본 손쥐 AECII의 (B) 대표 RNA 프로파일. 계산 린 계수와 함께 18S와 28S ribosomal RNA에 대한 특정 봉우리은 내가이 RNA 대표 AECII에서 그대로 분리 된 RNA에 대한 ntegrity 및 품질.
그림 3. 인플루엔자에 감염된 생쥐로부터 격리 기본 손쥐 AECII에서 바이러스 핵 단백질 (NP) 표현의 분석. C57Bl / 6 마우스가 intranasally 인산 투여 전에 AECII 절연에 일 1, 2 또는 3에 염분이나 인플루엔자 바이러스 PR8/A/34 버퍼 . (A) 감염되지 않은에서 폐 세포 현탁액의 대표 플롯뿐만 아니라 정렬 3 일 감염된 C57Bl / 6 마우스 스테인드. (B) 인플루엔자는 정렬 AECII의 바이러스 NP 표현은 NP 특정 항체 및 그 이후의 흐름 cytometric 분석 세포 염색법을 통해 분석되었다. (C) 표는 NP의 착색의 평균 형광 강도 (MFI)를 보여줍니다.
4 그림. 인플루엔자 바이러스 핵 단백질 (NP) 기본 손쥐 AECII를 감염 예 생체의 표현의 분석. 전 생체 독감 인플루엔자 바이러스 NP 6 세포 염색법에 의한 바이러스 감염 PR8/A/34 AECII의 (A) 대표 흐름 cytometric 분석 시간은 감염을 게시 할 수 있습니다. 예 생체 인플루엔자 다른 바이러스 dilutions을 AECII 6 H 게시물 감염 감염 바이러스의 NP-착색의 대표 결과 (B) 요약.
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Discussion
유동 세포 계측법에 의한 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은 기능과 분자 연구의 모든 범위의 마우스 폐에서 기본 셀을 액세스의 급속한 방법을 제공합니다. 설명 절차는 RNA 분리 (그림 2B 참조) transcriptome 연구로 직접 후속 분석을위한 번호 충분 AECII의 높은 가능한 순수 인구를 산출. 기능 어플리케이션의 경우, AECII 에어컨, 중간 또는 공동 문화 실험의 생성 예 수 있도록, 문화, 고립 된 세포를도 가능합니다. 특히 이러한 기능 연구에 대한 혜택으로 여기에 설명 된 바와 같이 부정적인 선택의 주요 세포의 분리는 항체 결합의 대상이 없었다 손길이 닿지 않은 세포를 얻을. 그러나, 세포 라인에서 수행 그 이상의 주요 AECII에서 연구의 장점에도 불구하고, 이러한 기본 세포의 사용에 실질적인 제한이 있습니다. 숫자의 단순한 제한 옆에, 광범위한 검사를 필요로하는 연구의 요구 사항을 충족하지 않을 수있는 기본 AECII는 우리가 48 시간 돌아 평균 관찰 한 제한된 시간 동안 문화에서 살아 남기. 이러한 단기 문화 실험에서, 우리는 AECII 설치된 매체에서 사용 된 이후 assays의 성격에 문화 매체의 선택을 기반으로하고 IMDM (IMDM Glutamax, Gibco 고양이. 번호 31980)에 보충으로 만족스러운 결과를 달성 한 10% FCS 표준 항생제 및 0.25 MM β-메르 캅토 에탄올.
여기에 설명 된 프로토콜은 가능한 좋은 숫자 순수한 주요 손쥐 AECII 분리 비교적 간단하고 빠른 방법을 표시합니다. 분리 후 생긴 세포의 순도는 매우 셀 정렬의 절차에 따라 달라집니다. 제외 할 수있는 세포 인구의 명확하고 강한 착색은 SSC 높은 행사에 대한 엄격한 게이팅과 같은 똑같이 중요하므로 잘 유형으로 림프 세포와 contaminationsI 상피 세포는 최소화됩니다. 분리 된 세포의 수율에 관해서는, 우리는이는 원유 세포 현탁액의 준비뿐만 아니라 효소 소화에 따라 조직의 완전한 붕괴로 동안 튜브, 필터 meshes와 접시의 다양한 플러싱에 의해 극대화되어 관찰되었습니다. 주요 AECII 작업 중 하나 주요 이점은 그들이 호흡기의 질병으로 고통 호스트에서 직접 분리 할 수 있다는 것입니다. 이러한 AECII들은 자연 마이크로 환경에 존재하기 때문에 잘 생체 상황에를 반영 모든 요소에 노출 된 것입니다. 손쥐 모델로 작업 할 때 인간의 AECII 18, 19과는 달리, 이것은 실험 시스템의 광범위한 확장 할 수 있습니다. 우리는 면역 염증뿐만 아니라 폐의 바이러스 감염에 관한 연구에서이 활용되었습니다. 따라서 우리는 CD4으로 고통 생쥐에서 해당 AECII를 발견 + T 세포는 호흡기 염증이 inflammat의 다양한 표현 중재폐 면역 반응에게 3을 조절하기위한 자신의 가능성을 보여 ory 유전자. 또한, 우리는 자기 항원 자동 반응 CD4의 기능 활성화 + T 세포에서 결과 주요 histocompatibility 복합 클래스 II 분자를 통해 그 AECII 디스플레이가 게재 될 수 있습니다. 동시에 AECII는 Foxp3의 유도 + 규제 T 세포 4 증진 분비 요소에 의해 폐 허용 오차를 유지하고 있습니다.
폐의 바이러스 감염에 관해서는, 우리는 성공적으로 독감 바이러스에 감염된 생쥐에서 기본 AECII를 분리했습니다. 면역 세포의 상당한 숫자 (그림 3a를 참조) 감염에 대한 응답으로 폐에 모집으로 전체 폐 세포 현탁액의 작은 비율에 대한 위에서 언급 한 바와 같이, 여기 AECII 계정. 같이 독감 고립 된 세포 내에서 바이러스 핵 단백질 (NP)의 세포 염색 시간의 과정을 통해 바이러스 단백질의 증가 표현을 보여줍니다
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 바이오 안전성 수준이 샘플에서 기본 손쥐 AECII를 정렬에 기술 지원을위한 M. Höxter 감사드립니다.
이 작업은 DB에 독일 연구 재단 (DFG) (SFB587, TP B12 및 BR2221/1-1)와 하노버 바이오 메디컬 연구 학교 (DFG GSC 108)에서 AA에이고의 보조금에 의해 지원되었다. DB는 대통령의 이니셔티브 및 계약 번호 W2/W3-029에 따라 독일어 연구 센터의 Helmholtz 협회 (HGF)의 네트워킹 기금에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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References
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