Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.
In den letzten Jahren hat sich der Beitrag des alveolären Typ II Epithelzellen (AECII), um verschiedene Aspekte der Immunregulation in der Lunge zunehmend anerkannt. AECII Es wurde gezeigt, der Zytokinproduktion in entzündeten Atemwegen teilzunehmen und sogar als Antigen-präsentierende Zellen sowohl Infektion und T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen 1-8. Daher sind sie besonders interessant auch in klinischen Kontexten wie Atemwegs-Hyperreaktivität der Außen-und Selbst-Antigene sowie Infektionen, die direkt oder indirekt abzielen AECII. Allerdings bleibt unser Verständnis der detaillierten immunologische Funktionen durch alveolare Typ II Epithelzellen in der gesunden Lunge sowie bei Entzündungen serviert fragmentarisch. Viele Studien zur AECII Funktion erfolgt über Maus oder Mensch Alveolarepithelzellen Zelllinien 9-12. Arbeiten mit Zelllinien bietet sicherlich eine Reihe von Vorteilen, wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von großen Zahlen of Zellen für umfangreiche Analysen. Wir glauben jedoch, die Verwendung von primären murinen AECII ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle dieses Zelltyps in komplexen Prozessen wie Infektionen oder Autoimmunerkrankungen Entzündungen. Primäre murine AECII können direkt von Tieren, die an solchen Atemwegserkrankungen, das heißt, sie galten alle weiteren äußeren Faktoren eine Rolle spielen, in der analysierten Einstellung isoliert werden. Als ein Beispiel können lebensfähige AECII aus Mäusen intranasal mit Influenza A-Virus, das in erster Linie an diese Zellen zur Replikation 13 infiziert isoliert werden. Wichtig ist, dass durch die ex vivo Infektion AECII von gesunden Mäusen isoliert, können Untersuchungen der zellulären Reaktionen auf die Infektion montiert werden weiter ausgebaut.
Unser Protokoll für die Isolierung von primären murinen AECII auf enzymatische Verdauung des Mauslunge durch Markieren des resultierenden Zellsuspension mit Antikörpern, die für CD11c, CD11b, gefolgt F4/80 basiert,CD19, CD45 und CD16/CD32. Körnigen AECII werden dann als unmarkiertem und seitliche Streuung hoch (SSC hoch) Zellpopulation identifiziert und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung 3 getrennt.
Im Vergleich zu alternativen Methoden zur Isolierung von primären Epithelzellen aus Mauslungen ergibt unserem Protokoll für die durchflusszytometrische Isolierung AECII durch negative Selektion unberührt, sehr überlebensfähig und pure AECII in relativ kurzer Zeit. Zusätzlich und im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren zur Isolierung durch Schwenken und Depletion von Lymphozyten durch Bindung von Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen 14, 15, ermöglicht flusszytometrischen Zellsortierung Diskriminierung mittels Zellgröße und Granularität. Da Instrumentation für die durchflusszytometrische Zellsortierung zur Verfügung steht, kann das beschriebene Verfahren bei relativ niedrigen Kosten angewendet werden. Neben Standard-Antikörpern und Enzymen für Lungen-Zerfall, keine zusätzlichen Reagenzien wie z. B. magnetischeKügelchen benötigt. Die isolierten Zellen eignen sich für eine breite Palette von funktionellen und molekularen Studien, die in vitro Kultur und T-Zell-Stimulation Assays sowie Transkriptom-, Proteom oder Sekretom Analysen 3, 4 enthalten.
Unser Protokoll für die Isolierung von murinen AECII durchflusszytometrisch bietet einen schnellen Weg für den Zugriff primären Zellen aus der Maus Lunge für eine ganze Reihe von funktionellen und molekulare Studien. Das beschriebene Verfahren liefert sehr überlebensfähig und reine Populationen AECII, die in ausreichender Zahl zur direkten nachfolgenden Analysen, wie RNA-Isolierung (siehe Bild 2b) und Transkriptom Studien sind. Für funktionelle Anwendungen ist es auch möglich, die Kultur isolier…
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten M. Höxter für die technische Unterstützung bedanken Sortieren primären murinen AECII vom Sicherheitsstufe 2 Proben.
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an die DB (SFB587, TP B12 und BR2221/1-1) und einem Stipendium der Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108), AA unterstützt. DB wird durch die Initiative des Präsidenten und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) unter Vertrag Anzahl W2/W3-029 unterstützt.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |