Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.
Geçen yıllar boyunca, akciğer immün regülasyon çeşitli yönleriyle alveolar tip II epitel hücreleri (AECII) katkısı giderek kabul edilmiştir. AECII iltihaplı hava yollarında sitokin üretimini katılmak ve enfeksiyon ve T-hücre aracılı otoimmünite 1-8 hem de hücreler antijen sunan bile hareket etmek gösterilmiştir. Bu nedenle, bu tür hava yolu hiper reaktivitesi gibi klinik bağlamlarda da özellikle ilginç yabancı ve hem de self-antijenlere doğrudan veya dolaylı AECII hedef enfeksiyonlar. Bununla birlikte, sağlıklı akciğer yanı sıra enflamasyon alveolar tip II epitel hücreleri tarafından sunulan ayrıntılı immünolojik işlevlerini anlaşılmasında düzensizdir. AECII fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma 9-12 fare, veya insan alveoler epitel hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Hücre hatları ile çalışmak kesinlikle böyle büyük sayılar durumu o gibi, faydaları sunarkapsamlı analizler için f hücreler. Bununla birlikte, birincil murin AECII kullanımı ile enfeksiyon ya da otoimmün iltihabı gibi karmaşık işlemler olarak bu hücre tipinin rolü daha iyi anlaşılmasını sağlar inanıyoruz. Primer mürin AECII bunlar analiz ortamında bir rol oynayan ek dış faktörler işlemine tabi tutulmuştur, yani bu gibi solunum durumları olan hayvanlardan doğrudan izole edilebilir. Bir örnek olarak, uygun intranazal AECII öncelikle çoğaltma 13 için bu hücreler hedef grip A virüsü ile enfekte olan fareler izole edilebilir. Önemlisi, sağlıklı farelerin izole AECII ex vivo enfeksiyon yoluyla, enfeksiyon üzerine monte hücresel cevaplarının çalışmalar daha uzun olabilir.
Birincil mürin AECII ve izolasyon için protokol, CD11c, CD11b, F4/80 için spesifik antikorlar ile elde edilen hücre süspansiyonu etiketleme ardından fare akciğer enzimatik sindirim dayanmaktadırCD19, CD45 ve CD16/CD32. Granül AECII sonra yüksek etiketsiz ve yan dağılım (SSC yüksek) hücre popülasyonu olarak belirlenmiş ve 3 sıralama floresan aktive hücre ile ayrılır.
Fare akciğerlerinden primer epitelyal hücreler izole alternatif yöntemler karşılaştırıldığında, negatif seçimin AECII akım sitometri izolasyonu için bizim protokol nispeten kısa bir süre içinde dokunulmaz, son derece canlı ve saf AECII verir. Buna ek olarak, ve kaydırma ve lenfosit azalması ile izolasyon geleneksel yöntemlerin aksine, antikor-coupled manyetik boncuklar 14, 15 bağlayıcı aracılığı ile, akış sitometrik hücre-hücre boyut ayırma ve ayrıntı ile ayırt etme izin verir. Akım sitometrik hücre sıralama için enstrümantasyon kullanılabilir olduğunu göz önüne alındığında, açıklanan prosedür nispeten düşük maliyetle uygulanabilir. Standart antikor ve akciğer dağılma için enzimler, manyetik olarak herhangi bir reaktif madde yanındaboncuklar gereklidir. İzole hücrelerinin in vitro kültürü ve T-hücre uyarma deneylerinde de transcriptome, proteom veya secretome analizi 3, 4, olarak dahil işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.
Flow sitometri ile murin AECII ve izolasyonu için bizim protokol fonksiyonel ve moleküler çalışmalar bir dizi için fare akciğer primer hücrelerin erişmenin hızlı bir yol sunar. Açıklanan prosedür böyle bir RNA izolasyonu (şekil 2b bakın) ve transcriptome çalışmaları gibi doğrudan sonraki analizler için sayıca yeterli AECII son derece canlı ve saf popülasyonlarının verir. Fonksiyonel uygulamalar için, AECII şartlandırılmış ortam ya da ko-kültür deneylerinden elde edile…
The authors have nothing to disclose.
Biz biyogüvenlik düzeyi 2 örneklerinden birincil fare AECII sıralama içinde teknik yardım için M. Höxter teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma DB Alman Araştırma Topluluğu (DFG) (SFB587, TP B12 ve BR2221/1-1) ve Hannover Biyomedikal Araştırma Okulu (DFG GSC 108) AA bir nakit hibe ile desteklenmiştir. DB Başkan Girişimi ve sözleşme numarası W2/W3-029 altında Alman Araştırma Merkezleri Helmholtz Derneği (HGF) ve Ağ Fonu tarafından desteklenmektedir.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |