Summary
Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.
Abstract
Durante gli ultimi anni, il contributo delle cellule alveolari di tipo II epiteliali (AECII) a vari aspetti della regolazione immunitaria nel polmone è stato sempre più riconosciuto. AECII hanno dimostrato di partecipare alla produzione di citochine in vie aeree infiammate ed agire anche come cellule presentanti l'antigene sia infezione e cellule T mediata autoimmunità 1-8. Pertanto, essi sono particolarmente interessanti anche in contesti clinici, quali vie aeree iper-reattività estera e di auto-antigeni così come le infezioni che direttamente o indirettamente si rivolgono AECII. Tuttavia, la nostra comprensione delle funzioni immunologiche dettagliate serviti da cellule alveolari di tipo II epiteliali nel polmone sano così come in infiammazione rimane frammentario. Molti studi in materia di funzione AECII vengono eseguite utilizzando il mouse o umani linee cellulari epiteliali alveolari 9-12. Lavorando con linee cellulari offre sicuramente una serie di vantaggi, come la disponibilità di grandi numeri of cellule per analisi approfondite. Tuttavia, riteniamo che l'uso di primaria AECII murino permette una migliore comprensione del ruolo di questo tipo di cellule in processi complessi come infezione o infiammazione autoimmune. Primaria AECII murino possono essere isolati direttamente da animali affetti da tali disturbi respiratori, nel senso che sono stati sottoposti a tutti gli altri fattori estrinseci che giocano un ruolo nel contesto analizzato. Come esempio, AECII vitali possono essere isolate da topi infettati intranasale con virus influenzale A, che colpisce principalmente queste cellule per la replicazione 13. È importante sottolineare che, attraverso l'infezione ex vivo di AECII isolati da topi sani, gli studi sulle risposte cellulari montati su di infezione può essere ulteriormente estesa.
Nostro protocollo per l'isolamento di primaria AECII murino si basa sulla digestione enzimatica del polmone topo seguita da etichettare la sospensione cellulare risultante con anticorpi specifici per CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulari vengono identificate come la dispersione non marcato e lateralmente alta (SSC alta) popolazione cellulare e sono separati da fluorescenza activated cell smistamento 3.
In confronto ai metodi alternativi di isolare cellule epiteliali primarie da polmoni di topo, il nostro protocollo per l'isolamento di citometria a flusso AECII per selezione negativa produce intatta, altamente puro AECII vitale e in tempi relativamente brevi. Inoltre, e in contrasto con i metodi convenzionali di isolamento di panning e deplezione dei linfociti tramite legame di anticorpo-accoppiati biglie magnetiche 14, 15, citometria a flusso di cellule ordinamento consente discriminazione attraverso dimensione cellulare e granularità. Dato che la strumentazione per selezione cellulare citofluorimetrica è disponibile, la procedura descritta può essere applicata a costi relativamente bassi. Accanto a anticorpi standard e enzimi per la disintegrazione del polmone, senza reagenti aggiuntivi, come magneticoperline sono richiesti. Le cellule isolate sono adatti per un'ampia gamma di studi funzionali e molecolari, che comprendono la coltura in vitro di cellule T e saggi di stimolazione così come trascrittoma, proteoma o analisi secretoma 3, 4.
Protocol
Dettagli relativi reagenti e materiali necessari sono elencati nella tabella alla fine del protocollo di seguito. Prima di iniziare il lavoro, preparare 15 ml provette (uno per topo) contenente 4 ml di dispasi e pre-riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua. In un blocco riscaldante, poco riscaldare piccole aliquote di 1% agarosio a bassa fusione (in acqua) a 95 ° C fino liquefatto e poi raffreddare a 45 ° C fino all'utilizzo.
1. Preparazione del polmone mouse
- Sacrifica il mouse CO 2 asfissia. Nota: Non eseguire dislocazione cervicale come questo danneggerà la trachea affinché seguendo fasi del protocollo, come l'installazione del polmone di liquido, non può essere eseguita con successo. Garantire perdita dei riflessi nocicettivi.
- Spruzzare il mouse con etanolo e fare un taglio lungo la linea mediana ventrale del corpo. Tirare il pelo e la pelle ventrale e, successivamente, anche con attenzione tagliare e rimuovere il peritoneo.
- Exsanguinate l'topo tagliando la vena giugulare sinistra e destra (Vena jugularis) e l'arteria renale (renalis Arteria). Rimuovere il sangue che scorre con il tessuto.
- Attenzione puntura e rimuovere il diaframma per esporre il cuore e polmone tagliando via le costole. Fare attenzione a non danneggiare il polmone.
- Con una cannula 26G e una siringa da 10 ml riempita con fosfato fredda tamponata (PBS), forare il ventricolo destro del cuore e la perfusione polmonare con PBS fino libera di sangue.
- Tagliare e rimuovere le ghiandole salivari per esporre la trachea. Anche tagliare con cautela il muscolo che circonda la trachea.
- Inserire una cannula 22G inabitazione nella trachea, rimuovere l'ago e spingere il catetere di plastica verso il polmone. Fissare il catetere legando un piccolo pezzo di filo intorno trachea e il catetere.
2. La digestione enzimatica del tessuto polmonare
Se desiderato, un campione di liquido di lavaggio broncoalveolare può esserepreparato dal lavaggio dei polmoni attraverso il catetere inserito nella trachea con PBS o mezzo prima del passaggio successivo.
- Utilizzando una siringa da 2 ml, accuratamente infondere un volume massimo di 2 ml di dispasi (dal aliquota 4 ml) nel polmone attraverso il catetere in modo che tutti i lobi sono completamente espanso. Scambiare la siringa con una siringa da 1 ml contenente 0,5 ml di agarosio liquefatto e anche instillare nel polmone.
- Lasciare la siringa sul catetere per evitare il riflusso del agarosio e coprire immediatamente il polmone con carta velina laboratorio e ghiaccio. Lascia il gel di agarosio per un paio di minuti.
- Rimuovere la carta velina, ghiaccio, siringa e catetere, tagliare la trachea e le accise il cuore, polmone e del timo dal petto. Risciacquare il polmone in un piatto con PBS e rimuovere il, timo cuore e trachea rimanente.
- Mettere il polmone nelle restanti 2 ml di dispasi e incubare a temperatura ambiente per 45 min.
3. Preparazione del polmoneSospensione cellulare
- Rimuovere il polmone dal dispasi e trasferirlo in un piatto contenente 7 ml di anticorpo anti-CD16/32 (1 ug / ml concentrazione finale) in DMEM e 100 microlitri DNasi.
- Utilizzando pinze, completamente disintegrare il tessuto polmonare tirandolo a parte e incubare per 10 min a temperatura ambiente mentre agitando lentamente su un agitatore impostato a 200 rpm. Se desiderato, la sospensione cellulare può essere conservato a 4 ° C fino alla fase successiva.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso maglie nylon prima con 100 micron e successivamente con 70 pm, 48 pm e 30 micron pori. Prendono cura di risciacquare ogni maglia nonché i tubi e piatti accuratamente con DMEM per minimizzare la perdita di cellule e massimizzare la resa. Se in comune tutti i campioni, questo può essere realizzato da qui passando successivamente sospensioni cellule da topi di un gruppo attraverso lo stesso filtro. Sostituire il filtro in caso di intasamento.
- A seconda del volume, trasferire il filtrato a uno o più provette da 50 ml ecentrifugare per 15 minuti a 160 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi degli eritrociti (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) e rapidamente terminare lisi mediante aggiunta di 13 ml di terreno DMEM. Trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml e centrifugare per 12 min a 160 xg e 4 ° C.
4. Colorazione anticorpi per citometria a flusso Cell-ordinamento
- Risospendere le cellule in 3 ml di cocktail di anticorpi primari, preparati in DMEM a diluizioni adatte per citometria a flusso. (Anticorpi precedentemente titolata per diluizioni ottimali di lavoro colorando 1 x 10 6 splenociti in un volume di 100 pl. Uso 3 ml di cocktail anticorpo primario contenente le concentrazioni ottimali per ciascuno degli anticorpi utilizzati per le celle pool da cinque topi. Se più topi sono raggruppati per un campione, regolare il volume).
- Per la colorazione, incubare le cellule per 10 minuti al buioa 4 ° C.
- Lavare le cellule riempiendo il tubo 15 ml di DMEM e centrifugazione per 12 min a 160 xg e 4 ° C.
- Nel caso in cui gli anticorpi disaccoppiati o biotinilato sono stati utilizzati in 4.1: Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 2-3 ml cocktail di anticorpi secondari. Colorazione per 10 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule attraverso il tubo di riempimento con DMEM e centrifugazione per 12 min a 160 xg e 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM e pre-filtro attraverso un filtro 50 micron in un tubo per cellula-ordinamento. Opzionale: Contare le cellule per ottenere il numero totale delle cellule in sospensione di cellule del polmone.
5. Cell-ordinamento
- Mescolare le cellule nel vortex prima cernita. Utilizzare un ugello 100 micron per la cella-cernita dei AECII. Pressione del fluido guaina nonché emissione laser e lunghezze d'onda di rilevamento dipendono strumento utilizzato per citometria a flusso di cellule ordinamento nonché i fluorocromi usati nella antibody colorazione procedura.
- Porta sulle cellule SSC alti che sono negativi per i fluorocromi utilizzati per la colorazione e l'ordinamento in una provetta contenente DMEM. Utilizzare in avanti altezza scatter (FSC-H) vs area (FSC-A) e l'altezza dispersione laterale (SSC-H) vs area (SSC-A) di Windows per escludere eventuali doppiette o aggregati cellulari (vedi dettagli della strategia di gating in Figura 1 a).
- Per raccogliere la centrifuga ordinati cellule per 20 minuti a 280 xg e 4 ° C.
- Risospendere le cellule in coltura-medio o tampone come richiesto per la successiva analisi.
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Representative Results
Quando si ordina sospensioni di cellule polmonari isolati da topi sani, il cancello AECII in genere rappresentano circa il 42 ± 10% di tutti gli eventi. Tale percentuale può essere notevolmente inferiore quando topi con patologie respiratorie come una infezione virale vengono utilizzati, come la sospensione cellulare iniziale conterrà una percentuale notevolmente più elevata di linfociti e di altre cellule immunitarie reclutati per le vie respiratorie. Per AECII isolata da polmoni IAV infetti al giorno 3 dopo l'infezione, abbiamo osservato una riduzione della frequenza delle cellule del cancello AECII di circa il 50%.
Una specie tipica e ri-analisi delle cellule filtrate è rappresentato nelle figure 1 be 1 c. Come indicato, la purezza delle cellule isolate rappresenta circa 92 ± 5%. In figura 2a, si dimostra che la separazione successo di popolazioni cellulari pure può essere confermata mediante colorazione per tensioattivi-proteine C, che è espressa esclusivamenteAECII 16, 17.
Abbiamo osservato che il numero di AECII isolato per ciascun animale dipende fortemente dal ceppo di topi utilizzati. Considerando che topi BALB / c genere permette di ottenere 1 x 10 6 AECII / mouse, il ceppo C57Bl / 6 solo i rendimenti 1-3 x 10 5 AECII / mouse. Il numero di topi utilizzati per esperimento dipende quindi dal ceppo di topo come pure il tipo di analisi successive da eseguire.
Per quanto riguarda la sostenibilità del AECII recuperate, si possono trovare i tassi di redditività di circa il 90% a seguito citometria a flusso delle cellule-ordinamento. L'alta percentuale di cellule vitali permette poi diretti analisi funzionali così come a breve termine cultura del isolato AECII murino primario.
Figura 1. Presentazione over la strategia di gating utilizzato per l'isolamento di citometria a flusso primario AECII murino per selezione negativa. (A) Schema sulla strategia di gating. (B) appezzamenti rappresentativi di una sorta di sospensione cellule del polmone. (C) Risultato Rappresentante di una nuova analisi delle celle filtrate. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Caratterizzazione e analisi molecolare della ordinati AECII murino primario. (A) Cytospins di AECII ordinati sono state colorate per il tensioattivo proteina C (SPC). Rispetto a contrasto di fase, quasi il 100% delle cellule sono risultate positive SPC. (B) Rappresentante profilo di RNA ordinati AECII primario murino dopo RNA-isolamento. Cime specifiche per 18S e 28S RNA ribosomiale, insieme con il fattore calcolato RIN RNA rappresentano i ntegrity e qualità per intatte RNA isolato da AECII.
Figura 3. Analisi della nucleoproteina del virus dell'influenza A (NP) espressione in primaria AECII murine isolate da topi infettati. Topi C57BL / 6 sono stati intranasale tampone fosfato o virus PR8/A/34 nei giorni 1, 2 o 3 prima dell'isolamento AECII . (A) appezzamenti rappresentativi di sospensioni cellulari da un polmone infetto nonché tre giorni infetto macchiati topo C57Bl / 6 per l'ordinamento. (B) Influenza Un'espressione NP virus in AECII ordinati stata analizzata mediante colorazione intracellulare con un NP-anticorpo specifico e la successiva analisi di citometria a flusso. (C) La tabella mostra l'intensità di fluorescenza media (MFI) della colorazione NP.
Figura 4. Analisi del virus influenzale A nucleoproteina (NP) espressione in ex vivo infetto primario murino AECII. (A) Rappresentante citometria a flusso analisi ex vivo dell'influenza A PR8/A/34 AECII virus ha infettato mediante colorazione intracellulare per il virus influenzale A PN 6 ore dopo l'infezione. (B) Sintesi dei risultati rappresentativi NP-colorazione ex vivo virus infetta AECII 6 ore dopo l'infezione con diluizioni di virus diversi.
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Discussion
Nostro protocollo per l'isolamento di AECII murino mediante citometria a flusso offre un modo rapido di accedere cellule primarie del polmone mouse per tutta una serie di studi funzionali e molecolari. La procedura descritta produce popolazioni altamente vitali e puro di AECII che sono in numero sufficiente per le successive analisi dirette, come l'RNA isolamento (vedi figura 2b) e studi del trascrittoma. Per applicazioni funzionali, è anche possibile per coltivare le cellule isolate, consentendo ad esempio la generazione di mezzo AECII condizionata o esperimenti di co-coltura. Come un vantaggio soprattutto per questi studi funzionali, l'isolamento di cellule primarie per selezione negativa come descritto qui produce cellule intatte, che non sono state oggetto di legame degli anticorpi. Tuttavia, nonostante i vantaggi di studi in AECII primaria su quelle effettuate in linee cellulari, vi sono limiti pratici l'uso di queste cellule primarie. Accanto alla limitazione mero numeri, Che potrebbe non soddisfare i requisiti di studi che richiedono uno screening esteso, primario AECII sopravvivere in cultura solo per un tempo limitato che abbiamo osservato in media circa 48 ore. In questi breve termine esperimenti di coltura, si è basata la scelta del mezzo di coltura sulla natura dei dosaggi successivi è stato usato il mezzo condizionato in AECII e hanno ottenuto risultati soddisfacenti con IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. No. 31.980) integrato con 10% di FCS, antibiotici standard e 0,25 mM β-mercaptoetanolo.
Il protocollo qui descritto mostra un modo relativamente semplice e rapido di isolare vitale e pura AECII primario murino in buon numero. La purezza delle cellule ha prodotto dopo la separazione dipende strettamente dalla procedura di cell-ordinamento. Una colorazione chiara e forte delle popolazioni cellulari che sono da escludere è altrettanto importante come gating stringenti sugli eventi SSC elevati, in modo che le contaminazioni con cellule linfoidi come tipo benI cellule epiteliali sono minimizzate. Per quanto riguarda la resa di cellule separate, abbiamo osservato che questo è massimizzato lavaggio estensivo di tubi, mesh e piastre filtranti durante la preparazione della sospensione di cellule grezzo nonché dalla completa disintegrazione del tessuto dopo digestione enzimatica. Un vantaggio principale di lavorare con AECII primaria è che possono essere isolati direttamente da host affetti da malattie delle vie respiratorie. AECII genere è esposto a tutti i fattori presenti nel loro naturale micro-ambiente e quindi ben riflettono la situazione in vivo. A differenza di umana AECII 18, 19, può essere esteso ad una vasta gamma di sistemi sperimentali quando si lavora in modelli murini. Abbiamo approfittato di questo in studi riguardanti l'infiammazione autoimmune così come infezione virale del polmone. Così abbiamo trovato che AECII da topi affetti da cellule T CD4 + mediato infiammazione respiratoria esprimere una vasta gamma di inflammatOry geni che dimostra il loro potenziale di regolare le risposte immunitarie polmonari 3. Inoltre, abbiamo dimostrato che il display AECII auto-antigeni attraverso complesso maggiore di istocompatibilità di classe II molecole che provoca l'attivazione funzionale di auto CD4 + cellule T reattive. Allo stesso tempo mantenere AECII tolleranza polmone da fattori secernono promuovono l'induzione di Foxp3 + cellule T regolatorie 4.
Per quanto riguarda l'infezione virale del polmone, siamo riusciti a isolati AECII primaria da topi infettati con virus A dell'influenza. Come menzionato sopra, qui conto AECII Una percentuale inferiore della sospensione cellula intera polmonare, come un numero considerevole di cellule immunitarie sono reclutati ai polmoni in risposta a infezione (vedere figura 3a). Colorazione intracellulare della nucleoproteina del virus dell'influenza A (NP) all'interno delle cellule isolate mostra crescente espressione della proteina virale nel corso del tempo, come mostrato in
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare M. Höxter per l'assistenza tecnica di ordinamento primario AECII murino dal livello di biosicurezza 2 campioni.
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la ricerca tedesca (DFG) a DB (SFB587, TP B12 e BR2221/1-1) e una borsa di studio dalla Scuola di Ricerca Biomedica di Hannover (DFG GSC 108) a AA. DB è supportato da Initiative del Presidente e del Fondo di rete dell'Associazione Helmholtz del tedesco Centri di Ricerca (HGF) con W2/W3-029 numero del contratto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
