Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Summary

Vi beskriver den hurtige isolering af primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) ved flowcytometrisk negativ selektion. Disse AECII viser høj levedygtighed og renhed og er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser af deres rolle i respiratoriske tilstande, såsom autoimmune eller infektiøse sygdomme.

Abstract

Gennem de seneste år har bidraget fra alveolære type II epithelceller (AECII) til forskellige aspekter af immun regulering i lungen i stigende grad blevet anerkendt. AECII har vist sig at deltage i cytokinproduktion i betændte luftveje og også fungere som antigenpræsenterende celler i både infektion og T-cellemedieret autoimmunitet ^1-8. Derfor er de særligt interessant også i kliniske sammenhænge, ​​såsom luftvejene hyper-reaktivitet til udenrigs-og selv-antigener samt infektioner, der direkte eller indirekte rettet mod AECII. Men vores forståelse af de detaljerede immunologiske funktioner betjenes af alveolære type II epitelceller i den raske lunge samt i inflammation forbliver fragmentarisk. Mange undersøgelser vedrørende AECII funktion udføres ved anvendelse af muse-eller humane alveolære epitelcellelinier ^9-12. Arbejde med cellelinjer sikkert tilbyder en række fordele, såsom tilgængeligheden af ​​et stort antal of celler for omfattende analyser. Vi mener imidlertid, at anvendelsen af ​​primære murine AECII giver en bedre forståelse af den rolle, denne celletype i komplekse processer som infektion eller autoimmun inflammation. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr, der lider af sådanne luftvejssygdomme, hvilket betyder at de har været udsat for alle yderligere ydre faktorer spiller en rolle i den analyserede indstilling. Som et eksempel kan levedygtige AECII isoleres fra mus intranasalt inficeret med influenza A-virus, der primært retter sig mod disse celler til replikation ^13. Vigtigere, gennem ex vivo infektion af AECII isoleret fra raske mus, kan undersøgelser af de cellulære reaktioner monteret ved infektion forlænges yderligere.

Vores protokol til isolering af primære murine AECII er baseret på enzymatisk fordøjelse af muselunge efterfulgt af mærkning af den resulterende cellesuspension med antistoffer specifikke for CD11c, CD11, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII derefter identificeret som det umærkede og sideværts spredning høj (SSC ^høj) cellepopulation og adskilles ved fluorescensaktiveret cellesortering ^3.

I forhold til alternative fremgangsmåder til isolering af primære epitelceller fra muselunger, giver vores protokol til flowcytometrisk isolering af AECII ved negativ selektion uberørt, meget levedygtig og ren AECII på forholdsvis kort tid. Derudover og i modsætning til konventionelle fremgangsmåder til isolering ved at panorere og udtømning af lymfocytter via binding af antistof-koblede magnetiske perler ^{14, 15,} tillader flowcytometrisk celle-sortering diskrimination ved cellestørrelse og granularitet. Eftersom instrumentering til flowcytometrisk cellesortering er tilgængelig, kan den beskrevne procedure anvendes ved relativt lave omkostninger. Ved siden af ​​standard-antistoffer og enzymer til lunge disintegration, ingen yderligere reagenser såsom magnetiskperler er nødvendige. De isolerede celler er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser, som omfatter in vitro-dyrkning og T-celle stimulation assays samt transkriptom, proteom eller secretome analyser ^{3, 4.}

Protocol

Detaljer vedrørende nødvendige reagenser og materialer er anført i tabellen i slutningen af ​​protokollen nedenfor. Inden arbejdet påbegyndes, forberede 15 ml rør (en pr mus) indeholdende 4 ml dispase og præ-varm dem til 37 ° C i et vandbad. I en varmeblok, varme kort tid små portioner af 1% lavtsmeltende agarose (i vand) til 95 ° C, indtil flydende og derefter afkøles til 45 ° C indtil anvendelse.

1. Fremstilling af muselunge

1. Sacrifice musen ved CO ₂ kvælning. Bemærk: Udfør ikke cervikal dislokation, da dette vil skade luftrøret, så at der efter trin i protokollen, såsom installation af lungen med væske, kan ikke udføres korrekt. Sikre tab af nociceptive reflekser.
2. Sprøjte mus med ethanol og gøre en lang snit langs den ventrale midterlinjen af ​​kroppen. Træk den ventrale pels og hud og efterfølgende også omhyggeligt klippe og fjerne bughinden.
3. Exsanguinate denmus ved at skære i venstre og højre halsvene (Vena jugularis) og nyrearterien (Arteria renalis). Fjern strømmende blod med væv.
4. Omhyggeligt punktering og derefter fjerne membranen for at blotlægge hjerte og lunger ved at skære væk ribbenene. Vær særlig omhyggelig med ikke at skade lungerne.
5. Med en 26G kanyle og 10 ml sprøjte fyldt med koldt phosphatbufret saltvand (PBS), punktere den højre ventrikel af hjertet og perfundere lungen med PBS, indtil fri for blod.
6. Klip og fjern spytkirtlerne at blotlægge trachea. Også omhyggeligt skære musklen omkring luftrøret.
7. Indsæt en 22G indlagt kanyle ind i luftrøret, fjern kanylen og skub plastkateter mod lungen. Fastgør kateteret ved at binde et lille stykke garn omkring luftrøret og kateter.

2. Enzymatisk fordøjelse af lungevævet

Om ønsket kan en bronkoalveolær lavagevæske prøve værefremstilles ved skylning af lungerne gennem kateter indsat i luftrøret med PBS eller medium, før det næste trin.

1. Under anvendelse af en 2 ml sprøjte, forsigtigt instill en maksimal mængde på 2 ml dispase (fra 4 ml aliquot) ind i lungen gennem kateteret, således at alle kamre er fuldt udvidet. Bytter sprøjte med en 1 ml sprøjte indeholdende 0,5 ml af flydende agarose og også bibringe ind i lungen.
2. Forlade sprøjten på kateteret for at forhindre tilbagestrømning af agarosen og dækkes omgående lungen med laboratorie tissuepapir og is. Lad agarosegelen i nogle få minutter.
3. Fjern tissuepapiret, is, sprøjte og kateter, skæres i luftrøret og udskære lunge, hjerte og thymus fra brystet. Derefter skylles lungerne i en skål med PBS og fjerne hjerte, thymus og resterende trachea.
4. Sæt lungen i de resterende 2 ml dispase og inkuberes ved stuetemperatur i 45 min.

3. Fremstilling af LungCellesuspension

1. Fjern lungen fra dispase og overføre den til en skål indeholdende 7 ml anti-CD16/32 antistof (1 ug / ml slutkoncentration) i DMEM-medium, og 100 pi DNase.
2. Ved hjælp af en pincet, fuldstændigt nedbrydes lungevævet ved at trække den fra hinanden og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, medens ryst forsigtigt på en vippearm sat til 200 rpm. Om ønsket kan cellesuspensionen derefter opbevares ved 4 ° C indtil det næste trin.
3. Filtreres cellesuspensionen gennem nylon masker først med 100 um og derefter med 70 um, 48 um og 30 um porer. Sørge for at skylle hver maske samt rørene og retter grundigt med DMEM for at minimere tab af celler og maksimere udbyttet. Hvis man samle prøver, kan dette opnås her ved efterfølgende passerer celler suspensioner fra mus i en gruppe gennem det samme filter. Forny filteret i tilfælde af tilstopning.
4. Afhængigt af mængden, filtratet overføres til en eller flere 50 ml rør ogcentrifugeres i 15 minutter ved 160 x g og 4 ° C. Supernatanten fjernes.
5. Resuspender cellepelleten i 2 ml erytrocyt lysisbuffer (0,15 M _NH4CI, 0,01 M _KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) og hurtigt afslutte lysis ved tilsætning af 13 ml DMEM-medium. Opløsningen overføres til et 15 ml rør og centrifugeres i 12 minutter ved 160 x g og 4 ° C.

4. Antistoffarvning til flowcytometrisk Cell-sortering

1. Cellerne resuspenderes i 3 ml primært antistof cocktail, fremstillet i DMEM-medium i fortyndinger egnet til flowcytometri. (Antistoffer blev tidligere titreret for optimale arbejdsbetingelser fortyndinger ved farvning 1 x 10 ⁶ splenocytter i et volumen på 100 ul. Brug 3 ml af det primære antistof cocktail indeholdende de optimale koncentrationer for hver af de anvendte antistoffer til celler poolet fra op til fem mus. Hvis flere mus samles til én prøve, justere lydstyrken).
2. Til farvning, inkuberes cellerne i 10 minutter i mørkeved 4 ° C.
3. Vask cellerne ved at fylde 15 ml rør med DMEM-medium og centrifugering i 12 minutter ved 160 x g og 4 ° C.
4. I tilfælde ukoblede eller biotinylerede antistoffer blev anvendt i 4.1: Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 2-3 ml sekundært antistof cocktail. Stain i 10 minutter ved 4 ° C i mørke.
5. Vask cellerne ved fyldning af røret med DMEM og centrifugering i 12 min ved 160 x g og 4 ° C.
6. Cellerne resuspenderes i 1 ml DMEM og forfilter gennem et 50 um filter til et rør for celle-sortering. Valgfrit: Tæl cellerne til opnåelse af det samlede celleantal i lungerne cellesuspension.

5. Celle-sortering

1. Bland cellerne ved hvirvelbehandling før sortering. Brug en 100 um dyse for celle-sortering af AECII. Sheath fluidtryk samt laser emission og detektion bølgelængder afhænger af instrumentet anvendes til flowcytometrisk celle-sortering og de fluorochromer anvendes i Antibody farvningsprocedure.
2. Gate på SSC ^høje celler, der er negative for de fluorochromer anvendes til farvning og sortering i et glas indeholdende DMEM. Brug fremad scatter højde (FSC-H) vs område (FSC-A) og sidelæns scatter højde (SSC-H) vs område (SSC-A) vinduer for at udelukke eventuelle dubletter eller celleaggregater (se detaljer om gating strategi i Figur 1 a).
3. For at indsamle de sorterede celler centrifugeres i 20 minutter ved 280 x g og 4 ° C.
4. Resuspendere cellerne i kultur-medium eller puffer efter behov til efterfølgende analyse.

Representative Results

Når sortering lunge cellesuspensioner isoleret fra raske mus, vil AECII gate typisk tegner sig for omkring 42 ± 10% af alle begivenheder. Denne procentdel kan være mærkbart lavere, når mus med åndedrætssygdomme såsom en virusinfektion anvendes, som den oprindelige cellesuspension vil indeholde en væsentlig højere andel af lymfocytter og andre immunceller rekrutteret til luftvejene. For AECII isoleret fra iav inficerede lunger på dag 3 efter infektion har vi observeret en nedsættelse af hyppigheden af ​​celler i AECII gate med omkring 50%.

En typisk form samt re-analyse af de sorterede celler er afbildet i figur 1 b og 1 c. Som angivet, renheden af ​​de isolerede celler udgør ca 92 ± 5%. I figur 2a, viser vi, at en vellykket udskillelse af rene cellepopulationer kan bekræftes ved farvning for overfladeaktivt-proteiner C, som udtrykkes udelukkende vedAECII ^{16, 17.}

Har vi observeret, at antallet af AECII isoleret per enkelt dyr afhænger i høj grad af musen anvendte stamme. Henviser til BALB / c mus giver typisk 1 x 10 ⁶ AECII / mus, C57BL / 6 strain kun giver 1-3 x 10 ⁵ AECII / mus. Antallet af mus anvendt pr eksperiment afhænger derfor af musestamme samt typen af ​​efterfølgende analyser, der skal udføres.

Med hensyn til levedygtighed hentede AECII vi typisk finde levedygtighed på omkring 90% efter flowcytometrisk celle-sortering. Denne høje andel af levedygtige celler derefter tillader direkte funktionelle analyser samt kortfristet kultur af den isolerede primære murine AECII.

Figur 1. Oversigt over gating strategi anvendes til flowcytometrisk isolering af primære murine AECII ved negativ selektion. (A) Skematisk oversigt over gating strategi. (B) Repræsentative afbildninger af en lunge cellesuspension art. (C) Repræsentant resultat af en fornyet analyse af de sorterede celler. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Karakterisering og molekylær analyse af sorterede primære murine AECII. (A) Cytospins med sorteret AECII blev farvet for det overfladeaktive protein C (SPC). Sammenlignet med fasekontrastmikroskopi var næsten 100% af celler fundet SPC positive. (B) Repræsentant RNA profil af sorterede primære murine AECII efter RNA-isolation. Specifikke toppe for 18S og 28S ribosomale RNA sammen med de beregnede RIN faktor repræsenterer RNA i ntegrity og kvalitet for intakte isolerede RNA fra AECII.

Figur 3. Analyse af influenza A-virus-nukleoprotein (NP) ekspression i primære murine AECII isoleret fra inficerede mus. C57BL / 6 mus blev intranasalt phosphatbufret saltvand eller influenza A-virus PR8/A/34 på dag 1, 2 eller 3 før AECII isolation . (A) Repræsentative afbildninger af lunge cellesuspensioner fra en ikke-inficeret samt en tredages inficerede C57BL / 6 mus farves til sortering. (B) Influenza A virus NP ekspression i sorteret AECII blev analyseret ved hjælp af intracellulær farvning med et NP-specifikt antistof og efterfølgende flow-cytometrisk analyse. (C) Tabellen viser den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af NP-farvning.

s ">
Figur 4. Analyse af influenza A-virus-nukleoprotein (NP) ekspression i ex vivo inficerede primære murine AECII. (A) repræsentant flow-cytometrisk analyse af ex vivo influenza A-virus PR8/A/34 inficeret AECII ved intracellulær farvning for influenza A-virus NP 6 timer efter infektion. (B) Sammenfatning af repræsentative resultater fra NP-farvning af ex vivo influenza A-virus inficeret AECII 6 h efter infektion med forskellige virus fortyndinger.

Discussion

Vores protokol til isolering af murine AECII ved flowcytometri tilbyder en hurtig måde at få adgang primære celler fra muselunge for en lang række funktionelle og molekylære studier. Den beskrevne fremgangsmåde giver stærkt levedygtige og rene populationer af AECII som er tilstrækkelige i antal til direkte efterfølgende analyser, såsom RNA-isolering (se figur 2b) og transkriptom undersøgelser. For funktionelle anvendelser er det også muligt at dyrke de isolerede celler, hvilket tillader f.eks dannelsen af AECII konditioneret medium eller co-kultur eksperimenter. Som en fordel især for disse funktionelle undersøgelser, giver isolering af primære celler ved negativ selektion som beskrevet her uberørte celler som ikke har været genstand for antistofbinding. Til trods for fordelene ved undersøgelser vedrørende primær AECII forhold til dem udført i cellelinier, er der praktiske begrænsninger for brugen af ​​disse primære celler. Ved siden af ​​den blotte begrænsning i antal, Som måske ikke opfylder kravene i undersøgelser, der kræver omfattende screening, primær AECII overleve i kulturen kun for en begrænset tid, som vi har observeret, at i gennemsnit omkring 48 timer. I disse korte kultur eksperimenter har vi baseret valget af dyrkningsmedium af naturen af ​​de efterfølgende assays AECII konditionerede medium blev anvendt, og har opnået tilfredsstillende resultater med IMDM (IMDM Glutamax, Gibco kat. Nr. 31980) suppleret med 10% FCS, standard antibiotika og 0,25 mM β-mercaptoethanol.

Protokollen beskrevet her viser en forholdsvis nem og hurtig måde at isolere levedygtig og ren primær murine AECII i gode numre. Renheden af ​​de viste celler efter adskillelse afhænger kritisk af fremgangsmåden af ​​celle-sortering. En klar og stærk farvning af cellepopulationer, som skal udelukkes, er lige så vigtigt så strenge gating på SSC ^høje begivenheder, således at forurening med lymfoide celler samt typenI epitelceller minimeres. Med hensyn til udbyttet af separerede celler har vi observeret, at dette maksimeres ved omfattende skylning af rør, filter masker og plader under fremstillingen af ​​det rå cellesuspension og efter fuldstændig opløsning af vævet efter enzymatisk spaltning. En største fordel ved at arbejde med primær AECII er, at de kan isoleres direkte fra værter, der lider af sygdomme i luftvejene. Sådan AECII vil have været udsat for alle faktorer i deres naturlige mikro-miljø og derfor godt afspejler in vivo situationen. I modsætning til human AECII ^{18, 19,} kan dette blive udvidet til en lang række eksperimentelle systemer, når de arbejder i murine modeller. Vi har udnyttet denne i undersøgelser vedrørende autoimmun inflammation samt virusinfektion i lungen. Derved fandt vi, at AECII fra mus, der lider af CD4 ⁺ T-cellemedieret respiratorisk inflammation udtrykke en lang række inflammatORY gener, som demonstrerer deres potentiale for regulering lunge immunresponser ^3. Endvidere kunne vi vise, at AECII display selv-antigener gennem dominerende histokompatibilitetskompleks-klasse-II-molekyler, hvilket resulterer i den funktionelle aktivering af auto reaktive CD4 ⁺ T-celler. Samtidig AECII opretholder lunge tolerance ved secernere faktorer, der fremmer induktionen af foxp3 + regulerende T-celler ^4.

Med hensyn til viral infektion i lungen, har vi med succes isoleret primær AECII fra mus inficeret med influenza A virus. Som nævnt ovenfor her AECII udgør en mindre del af hele lungen cellesuspension, som betydeligt antal immunceller rekrutteres til lungerne som reaktion på infektion (se figur 3a). Intracellulær farvning af influenza A-virus-nukleoprotein (NP) inden for de isolerede celler viser øget ekspression af det virale protein i løbet af tid som vist i g> figurerne 3b og 3c. Disse AECII, udløst af virus in vivo, vise et værdifuldt redskab for undersøgelser vedrørende den molekylære og funktionelle fænotype af luftvejsepitel under respiratorisk virusinfektion samt under genopretning. Men da AECII er det primære mål for influenza A-virus, og der er betydelig ødelæggelse af epitel, antallet af celler gav fra inficerede mus aftager i løbet, og med sværhedsgraden af ​​infektionen. Også, idet virus gentagne gange replikerer og inficerer nye celler, har det isolerede AECII ikke været udsat for infektion på et enkelt defineret tidspunkt. Således er disse undersøgelser ideelt suppleret med forsøg med ex vivo inficerede primære murine AECII fra raske mus, hvor infektionen er bedre synkroniseret, og som, som bestemt ved intracellulær viral NP-farvning er vist i figurerne 4a og 4b, kan give højere infektion afhængigt af virusdosis anvendes.

jove_content "> Tilsammen flowcytometrisk negativ selektion som beskrevet her, viser en hurtig metode til isolering af rene og levedygtige primære murine AECII. Disse celler er egnede til en lang række analyser og er et værdifuldt redskab til at udvide vores viden om den rolle, AECII i immun regulering i luftvejene in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
indwelling cannula Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units)	BD Biosciences	354235	aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C
Biozym Plaque Agarose	Biozym	840101	1% w/v in H2O
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial	Sigma-Aldrich	D4263	freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES)
cell strainers (100 μm, 75 μm)	BD Falcon	352360, 352350
nylon mesh(48 μm, 30 μm)	Bückmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm filter	PARTEC	04-0042-2317
anti-mouse CD16/CD32	BioLegend	101302	clone 93; purified
anti-mouse F4/80	BioLegend	123116	clone BM8; APC coupled
anti-mouse CD11b	BioLegend	101208	clone M1/70; PE coupled
anti-mouse CD11c	BioLegend	117310	clone N418; APC coupled
anti-mouse CD45	BioLegend	103102	clone 30-F11; purified
anti-mouse CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE coupled
polyclonal goat anti-rat IgG	BD Pharmingen	550767	polyclonal, PE coupled
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available.