Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.
Ao longo dos últimos anos, a contribuição das células alveolares tipo II epiteliais (AECII) a vários aspectos da regulação imune no pulmão tem sido cada vez mais reconhecida. AECII têm sido mostrados para participar na produção de citoquina em inflamação das vias aéreas e ao mesmo actuar como células apresentadoras de antigénio, em ambos infecção e de células-T auto-imunidade mediada por 1-8. Por isso, eles são particularmente interessantes também em contextos clínicos, tais como hiper-reactividade ao estrangeiro e auto-antigénios, bem como infecções que, directa ou indirectamente como alvo AECII. No entanto, a nossa compreensão das funções imunológicas detalhadas servidas por células de tipo II alveolares epiteliais no pulmão saudável, bem como na inflamação permanece fragmentária. Muitos estudos sobre a função AECII são realizadas usando o mouse ou humanos alveolares linhas de células epiteliais 9-12. Trabalhando com linhas celulares certamente oferece uma série de vantagens, tais como a disponibilidade de grandes quantidades of células para análise extensiva. No entanto, nós acreditamos que a utilização de AECII murino primário permite um melhor entendimento sobre o papel deste tipo de células em processos complexos como infecção ou inflamação autoimune. AECII murino primário pode ser isolado directamente a partir de animais que sofrem de tais condições respiratórias, o que significa que foram sujeitos a todos os outros factores extrínsecos que desempenham um papel na definição analisados. Como um exemplo, AECII viável pode ser isolado a partir de murganhos intranasalmente infectados com o vírus influenza A, que tem como alvo as células principalmente para a replicação de 13. É importante notar que com a infecção ex vivo de AECII isolado de ratos saudáveis, os estudos das respostas celulares montadas sobre a infecção pode ser ainda mais alargado.
O protocolo para o isolamento de AECII murino primário é baseada na digestão enzimática do pulmão de rato seguido de rotulagem da suspensão de células resultante com anticorpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulares são, em seguida, identificada como a dispersão não marcado e para o lado de alta (SSC alta) da população de células e são separados por classificação de células activadas por fluorescência 3.
Em comparação com outros métodos de isolamento de células primárias epiteliais de pulmão de rato, o nosso protocolo para o isolamento de citometria de fluxo de AECII por selecção negativa produz intacta, AECII altamente viável e pura em tempo relativamente curto. Além disso, e em contraste com os métodos convencionais de isolamento por filtração e depleção de linfócitos através de ligação do anticorpo-esferas magnéticas acopladas 14, 15, por citometria de fluxo de células para triagem de discriminação permite que, por meio de tamanho celular e granularidade. Dado que a instrumentação de separação de células por citometria de fluxo está disponível, o processo descrito pode ser aplicado a custos relativamente baixos. Ao lado de anticorpos normais e enzimas para a desintegração do pulmão, não reagentes adicionais, tais como magnéticoGrânulos são necessários. As células isoladas são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares, que incluem a cultura in vitro e ensaios de estimulação de células T, bem como transcriptoma, proteoma ou análises secretoma 3, 4.
O protocolo para o isolamento de AECII murina por citometria de fluxo proporciona uma forma rápida de aceder a partir de células primárias do pulmão do rato para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares. O procedimento descrito proporciona populações altamente viáveis e puras dos AECII que são em número suficiente para directos análises subsequentes, tais como o isolamento de ARN (ver figura 2b) e os estudos de transcriptoma. Para aplicações funcionais, também é possível a…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a M. Höxter de assistência técnica para a classificação AECII murino primário de nível de biossegurança 2 amostras.
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) para DB (SFB587, TP B12 e BR2221/1-1) e uma bolsa da Escola de Pesquisa Biomédica Hannover (DFG GSC 108) para AA. DB é apoiada por iniciativa do Presidente e do Fundo de Networking da Associação Helmholtz de Centros de Pesquisa Alemão (HGF), sob W2/W3-029 número do contrato.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |