Summary
We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.
Abstract
In de afgelopen jaren, is de bijdrage van alveolaire type II epitheelcellen (AECII) diverse aspecten van immuunregulatie in de longen vaker erkend. AECII is aangetoond dat deel cytokine productie in ontstoken luchtwegen en zelfs als antigen-presenterende cellen in zowel infectie en T-cel gemedieerde auto-immuniteit 1-8. Daarom zijn ze bijzonder interessant ook binnen klinische vraagstellingen, zoals hyperreactiviteit van de luchtwegen bij buitenlandse en zelf-antigenen alsook infecties die direct of indirect richten AECII. Echter ons begrip van de gedetailleerde immunologische functies bediend door alveolaire type II epitheelcellen van gezonde long en in ontsteking blijft fragmentarisch. Veel studies over AECII functie worden uitgevoerd met behulp van de muis of mens alveolaire epitheliale cellijnen 9-12. Werken met cellijnen biedt zeker een aantal voordelen, zoals de beschikbaarheid van een groot aantal of cellen voor uitgebreide analyses. Echter, wij geloven het gebruik van primaire muriene AECII zorgt voor een beter begrip van de rol van dit type cel in complexe processen, zoals een infectie of auto-immuun ontsteking. Primaire murine AECII direct geïsoleerd uit dieren die lijden aan dergelijke ademhalingsproblemen, wat betekent dat ze zijn onderworpen aan de aanvullende extrinsieke factoren een rol spelen in de geanalyseerde setting. Als voorbeeld kan levensvatbare AECII worden geïsoleerd uit muizen intranasaal geïnfecteerd met influenza A-virus, die voornamelijk deze cellen richt voor replicatie 13. Belangrijker door ex vivo infectie van AECII geïsoleerd uit gezonde muizen, kan studies van de cellulaire responsen bevestigd na infectie worden verlengd.
Onze protocol voor de isolatie van primaire murine AECII is gebaseerd op enzymatische afbraak van de muizenlong gevolgd door etikettering van de resulterende celsuspensie met antilichamen specifiek voor CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 en CD16/CD32. Granulaire AECII worden vervolgens geïdentificeerd als ongelabelde en zijwaartse verstrooiing hoog (SSC hoog) celpopulatie worden gescheiden door fluorescentie geactiveerde celsortering 3.
In vergelijking met andere werkwijzen voor het isoleren primaire epitheelcellen muizenlongen, ons protocol voor flowcytometrische isolatie van AECII door negatieve selectie levert ongerepte zeer levensvatbare en zuivere AECII in relatief korte tijd. Bovendien, in tegenstelling tot conventionele methoden van isolatie door panning en uitputting van lymfocyten via binding van antilichaam-gekoppelde magnetische korreltjes 14, 15, flowcytometrische cell-sortering maakt onderscheid door celgrootte en granulariteit. Aangezien instrumentatie voor flowcytometrische celsortering beschikbaar is, kan de beschreven procedure worden toegepast tegen relatief lage kosten. Naast standaard antilichamen en enzymen voor long desintegratie geen extra reagentia zoals magnetischebeads vereist. De geïsoleerde cellen zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies, waaronder in vitro kweek en T-cel stimulatie assays en transcriptoom, proteoom of secretoom analyses 3, 4.
Protocol
Details over de vereiste reagentia en materialen worden vermeld in de tabel aan het einde van het protocol hieronder. Vóór aanvang bereiden 15 ml buisjes (een per muis) met 4 ml dispase en voorverwarmen ze tot 37 ° C in een waterbad. In een verwarmingsblok kort verwarmen kleine hoeveelheden van 1% laag smeltpunt agarose (in water) tot 95 ° C tot vloeibaar en vervolgens afkoelen tot 45 ° C tot gebruik.
1. Voorbereiding van de Muis Lung
- Offer de muis door CO 2 stikken. Opmerking: Voer geen cervicale dislocatie omdat dit de luchtpijp verwonden, zodat volgende stappen van het protocol, zoals de installatie van de long met vloeistof, kan niet met succes worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het verlies van nociceptieve reflexen.
- Spuit de muis met ethanol en een lange snede langs de ventrale middenlijn van het lichaam. Trek de ventrale vacht en huid en vervolgens ook zorgvuldig te schrappen en het buikvlies.
- Exsanguinate demuis door het snijden van de linker en rechter halsader (vena jugularis) en de nierslagader (Arteria renalis). Verwijder stromend bloed met weefsel.
- Zorgvuldig lekke band en verwijder het membraan naar het hart en de longen worden blootgesteld door het wegsnijden van de ribben. Wees extra voorzichtig dat u de longen beschadigen.
- Met een canule 26G en 10 ml spuit met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), doorboren de rechter ventrikel van het hart en de longen perfuseren met PBS tot deze bloed.
- Snij en verwijder de speekselklieren van de luchtpijp bloot te leggen. Ook zorgvuldig knippen de spieren rond de luchtpijp.
- Plaats een 22G inwoning canule in de luchtpijp, verwijder de naald en druk de plastic catheter in de richting van de longen. Bevestig de katheter door koppelverkoop een klein stukje draad om luchtpijp en de katheter.
2. Enzymatische afbraak van het longweefsel
Desgewenst kan een bronchoalveolaire lavage vloeistof monsterbereid door spoelen van de longen door de catheter ingebracht in de trachea met PBS of medium voor de volgende stap.
- Een 2 ml spuit voorzichtig inboezemen een maximaal volume van 2 ml dispase (4 ml van het monster) in de long via de katheter zodat alle lobben volledig geëxpandeerd. Wisselen spuit met een 1 ml spuit met 0,5 ml van de vloeibare agarose en druppelen in de longen.
- Laat de spuit op de katheter om terugstroming van de agarose te voorkomen en deze onmiddellijk de long met laboratorium tissuepapier en ijs. Laat de agarose gel een paar minuten.
- Verwijder het zijdepapier, ijs, spuit en catheter, snijd de luchtpijp en accijnzen de longen, het hart en de thymus van de borst. Spoel daarna de long in een schaal met PBS en verwijder het hart, de thymus en de resterende luchtpijp.
- Plaats de longen naar de resterende 2 ml dispase en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
3. Bereiding van de LungCelsuspensie
- Verwijder de longen van de dispase en breng deze in een schotel met 7 ml anti-CD16/32 antilichaam (1 pg / ml eindconcentratie) in DMEM medium en 100 ul DNase.
- Behulp van een tang, volledig uiteenvallen het longweefsel van elkaar te trekken en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtig schommelen op een rocker ingesteld op 200 rpm. Desgewenst kan de celsuspensie dan bewaard bij 4 ° C tot de volgende stap.
- Filter de celsuspensie door nylon mazen eerst met 100 urn en vervolgens met 70 urn, 48 urn en 30 urn poriën. Zorg elke maas spoelen en de buizen en gerechten grondig met DMEM om verlies van cellen te minimaliseren en te maximaliseren. Als u poolen van monsters, kan dit hier worden bereikt door vervolgens het passeren van cellen schorsingen van muizen van de ene groep door dezelfde filter stromen. Vernieuw het filter in het geval van verstopping.
- Afhankelijk van het volume, Breng het filtraat aan een of meer 50 ml buizen encentrifugeer 15 min bij 160 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 2 ml erytrocyten lysis buffer (0,15 M NH4Cl, 0,01 M KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) en snel lysis beëindigd door toevoeging van 13 ml DMEM medium. De oplossing wordt naar een 15 ml en centrifugeer gedurende 12 minuten bij 160 xg en 4 ° C.
4. Antilichaam Kleuring voor flowcytometrische cell-sortering
- Resuspendeer de cellen in 3 ml primair antilichaam cocktail, bereid in DMEM medium bij verdunningen geschikt voor flowcytometrie. (Antilichamen werden voorheen getitreerd voor optimale werkverdunningen door kleuring 1 x 10 6 splenocyten in een volume van 100 ul. Gebruik 3 ml van het primaire antilichaam cocktail met de optimale concentratie voor elk van de gebruikte antilichamen cellen samengevoegd uit maximaal vijf muizen. Als er meer muizen worden samengevoegd tot een monster, het volume aanpassen).
- Voor kleuring Incubeer de cellen gedurende 10 min in het donkerbij 4 ° C.
- Spoel de cellen door het vullen van de buis met 15 ml DMEM medium en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C.
- Bij ontkoppeld of gebiotinyleerde antilichamen werden gebruikt in 4.1: Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 - 3 ml secundair antilichaam cocktail. Vlek gedurende 10 min bij 4 ° C in het donker.
- Spoel de cellen door het vullen van de buis met DMEM en centrifugatie gedurende 12 min bij 160 xg en 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM en voorfilter door een 50 urn filter in een buis voor cel-sortering. Optioneel: Tel de cellen van het totale aantal cellen in de long celsuspensie te verkrijgen.
5. Cell-sortering
- Meng de cellen door vortexen voor sortering. Gebruik een 100 um mondstuk voor cel-sortering van AECII. Mantelvloeistof druk en laser emissie-en detektieinrichting golflengten afhankelijk van het instrument voor flowcytometrische cell-sortering en de fluorochromen in de ANTIBody kleuringsprocedure.
- Hek aan de SSC high cellen die negatief zijn voor de fluorochromen voor kleuring en sorteren in een buis die DMEM. Gebruik voorwaartse verstrooiing hoogte (FSC-H) vs gebied (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing hoogte (SSC-H) vs gebied (SSC-A) vensters om alle doubletten of celaggregaten sluiten (zie details van de gating strategie in Figuur 1 a).
- Om de gesorteerde cellen centrifuge inzamelen voor 20 min bij 280 xg en 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in kweek-medium of buffer als voor latere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het sorteren longcelsuspensies geïsoleerd uit gezonde muizen, zal de AECII poort doorgaans goed zijn voor ongeveer 42 ± 10% van alle gebeurtenissen. Dit percentage kan aanmerkelijk lager bij muizen met ademhalingsaandoeningen zoals een virale infectie worden gebruikt als de oorspronkelijke celsuspensie een aanzienlijk hoger percentage lymfocyten en andere cellen aangetrokken om de luchtwegen bevatten. Voor AECII geïsoleerd uit IAV geïnfecteerde longen op dag 3 na infectie we hebben waargenomen verlaging van de frequentie van cellen in de AECII gate met ongeveer 50%.
Een typische vorm en heranalyse van de gesorteerde cellen is weergegeven in figuren 1 b en 1 c. Zoals aangegeven is de zuiverheid van de geïsoleerde cellen vertegenwoordigt ongeveer 92 ± 5%. In figuur 2a tonen we aan dat succesvolle scheiding van pure celpopulaties kan worden bevestigd door kleuring voor oppervlakte-eiwitten C, die uitsluitend wordt uitgedrukt doorAECII 16, 17.
We hebben vastgesteld dat het aantal AECII die per dier sterk afhankelijk van de gebruikte muizenstam. Dat BALB / c muizen levert doorgaans 1 x 10 6 AECII / muis, de C57Bl / 6 stam alleen levert 1 - 3 x 10 5 AECII / muis. Het aantal gebruikte muizen per experiment dus afhankelijk van de muizenstam en het type verdere analyses uit te voeren.
Ten aanzien van de levensvatbaarheid van de opgehaalde AECII, we meestal vinden levensvatbaarheid van rond 90% naar aanleiding flowcytometrische cell-sortering. Dit hoge percentage levensvatbare cellen kunnen vervolgens direct functionele analyses, alsook op korte termijn de cultuur van de geïsoleerde primaire murine AECII.
Figuur 1. Overzicht over de gating strategie voor flowcytometrische isolatie van primaire murine AECII door negatieve selectie. (A) Schematisch overzicht van de gating strategie. (B) Vertegenwoordiger percelen van een long celsuspensie soort. (C) Vertegenwoordiger resultaat van een heranalyse van de gesorteerde cellen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Karakterisering en moleculaire analyse van primaire murine AECII gesorteerd. (A) Cytospins van gesorteerd AECII werden gekleurd voor de oppervlakte-actieve eiwit C (SPC). Vergeleken met fasecontrastmicroscopie werd bijna 100% van de cellen bevonden SPC positief. (B) Vertegenwoordiger RNA profiel van gesorteerd primaire murine AECII na RNA-isolatie. Specifieke pieken voor 18S en 28S ribosomaal RNA samen met de berekende RIN factor vormen RNA i ntegrity en kwaliteit voor intacte geïsoleerde RNA uit AECII.
Figuur 3. Analyse van het influenza A virus nucleoproteïne (NP) expressie in primaire murine AECII geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen. C57Bl / 6 muizen werden intranasaal toegediend fosfaat gebufferde zoutoplossing of influenza A virus PR8/A/34 op dag 1, 2 of 3 voor isolatie AECII . (A) Representative percelen longcelsuspensies een niet-geïnfecteerde en drie dagen geïnfecteerde C57Bl / 6 muis gekleurd voor sorteren. (B) Influenza A virus NP expressie in gesorteerd AECII geanalyseerd door intracellulaire kleuring met NP-specifiek antilichaam en vervolgens flow-cytometrische analyse. (C) De tabel toont de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van het NP kleuring.
Figuur 4. Analyse van het influenza A virus nucleoproteïne (NP) expressie in ex vivo geïnfecteerd primaire murine AECII. (A) Representative flow-cytometrische analyse van ex vivo influenza A virus geïnfecteerd PR8/A/34 AECII door intracellulaire kleuring voor het influenza A virus NP 6 hr na infectie. (B) Samenvatting van representatieve resultaten van NP-kleuring van ex vivo influenza A virus geïnfecteerd AECII 6 h na infectie met verschillende virusverdunningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze protocol voor de isolatie van muizen AECII door flowcytometrie biedt een snelle manier toegang primaire cellen uit de muizenlong voor een hele reeks van functionele en moleculaire studies. De beschreven procedure levert zeer levensvatbare en zuivere populaties van AECII die voldoende in aantal directe latere analyses zoals RNA isolatie (zie figuur 2b) en transcriptoom studies. Voor functionele toepassingen, is het ook mogelijk om cultuur de geïsoleerde cellen, waardoor bijvoorbeeld het genereren van AECII geconditioneerd medium of co-cultuur experimenten. Als een voordeel in het bijzonder voor deze functionele studies, het isoleren van primaire cellen door negatieve selectie zoals hier beschreven geeft ongerept cellen die niet zijn onderworpen aan antilichaambinding. Ondanks de voordelen van studies in primaire AECII boven die uitgevoerd cellijnen, zijn er praktische beperkingen aan het gebruik van deze primaire cellen. Naast de loutere beperking in aantallen, Die misschien niet aan de eisen van studies die uitgebreide screening voldoen primaire AECII overleven in cultuur alleen gedurende een beperkte tijd die we hebben een gemiddelde waargenomen rond 48 uur. In deze korte termijn kweek experimenten waren wij bij de keuze van kweekmedium van de aard van de volgende assays AECII het geconditioneerde medium gebruikt in en hebben bevredigende resultaten met IMDM (IMDM Glutamax, Gibco Cat. Nr. 31.980) aangevuld met 10% FCS, standaard antibiotica en 0,25 mM β-mercaptoethanol.
Het protocol hier beschreven geeft een relatief eenvoudige en snelle manier van isoleren levensvatbare en zuiver primaire murine AECII in goede aantallen. De zuiverheid van de cellen leverde na scheiding hangt kritisch af van de procedure van cel-sortering. Een duidelijke en sterke kleuring van de celpopulaties die worden uitgesloten is even belangrijk als stringent gating op de SSC hoge gebeurtenissen, zodat verontreinigingen met lymfoïde cellen en TypeI epitheelcellen geminimaliseerd. Over de opbrengst van gescheiden cellen, hebben wij waargenomen dat deze wordt geoptimaliseerd door uitgebreid spoelen van buizen, filter mazen en platen tijdens de bereiding van het ruwe celsuspensie en door volledige desintegratie van het weefsel na enzymatische digestie. Een belangrijk voordeel van het werken met primaire AECII is dat ze direct worden geïsoleerd van hosts lijden aan ziekten van de luchtwegen. Dergelijke AECII zal zijn blootgesteld aan alle factoren aanwezig zijn in hun natuurlijke micro-omgeving en dus goed de weerspiegeling in vivo situatie. In tegenstelling tot menselijke AECII 18, 19, kan dit worden uitgebreid tot een groot aantal experimentele systemen bij het werken in murine modellen. We hebben gebruik te maken van deze studies in termen autoimmune ontsteking en virale infectie van de longen. Daarbij bleek dat AECII van muizen die leden aan CD4 + T cellen gemedieerde ontsteking luchtwegen expressie diverse inflammatheugen genen die hun potentieel voor het reguleren long immuunresponsen 3 toont. Verder kunnen we dat AECII display zelfantigenen door major histocompatibility complex class II-moleculen waardoor de functionele activering van auto reactieve CD4 + T-cellen. Tegelijkertijd AECII handhaven long tolerantie secreteren factoren die de inductie van Foxp3 + regulerende T-cellen 4.
Ten aanzien van virale infectie van de longen hebben we met succes geïsoleerd uit primaire AECII muizen geïnfecteerd met influenza A virus. Zoals hierboven vermeld, hier AECII nemen een kleiner deel van de gehele long celsuspensie, als aanzienlijke hoeveelheden immuuncellen worden gerekruteerd naar de longen bij infectie (zie figuur 3a). Intracellulaire kleuring van het influenza A virus nucleoproteïne (NP) in de geïsoleerde cellen toont verhogen van de expressie van het virale eiwit in de loop van de tijd zoals weergegeven in
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen M. Höxter bedanken voor technische bijstand bij het sorteren primaire murine AECII van bioveiligheidsniveau 2 monsters.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Duitse Research Foundation (DFG) DB (SFB587, TP B12 en BR2221/1-1) en een beurs van de Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) tot AA. DB wordt ondersteund door initiatief van de president en Networking Fonds van de Helmholtz Vereniging van Duitse Research Centers (HGF) onder contract nummer W2/W3-029.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
|||
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
