Her vi viser en enkel og effektiv protokoll for generering av humane iPSCs 3-4 ml perifert blod ved hjelp av en enkelt lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering av lett tilgjengelige blodceller lover å akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø.
Gjennom ektopisk uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer, Oct4, Klf4, Sox2 og cMyc, kan menneskelige somatiske celler bli konvertert til en pluripotent tilstand, genererer såkalte induserte pluripotente stamceller (iPSCs) 1-4. Pasient-spesifikke iPSCs mangler etiske bekymringer som omgir embryonale stamceller (ESCs) og ville hoppe mulig immun avvisning. Dermed har iPSCs vakt betydelig oppmerksomhet for sykdom modellering studier, screening av farmakologiske stoffer, og regenerative terapier 5.
Vi har vist generering av transgene-frie mennesker iPSCs fra pasienter med ulike lungesykdommer hjelp av en enkelt excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Kassett (STEMCCA) koding Yamanaka faktorene 6. Disse IPSC linjer ble generert fra hudfibroblaster, den vanligste celletype som brukes for omprogrammering. Normalt, skaffe fibroblaster trenger en hud punch biopsi etterfulgt av ekspansjon av cellens i kultur for noen passasjer. Viktigere, har en rekke grupper rapporterte omprogrammering av humant perifert blod celler til iPSCs 7-9. I en studie ble en Tet induserbar versjon av STEMCCA vektor ansatt 9, som krevde blodcellene til å bli samtidig infisert med en konstitutivt aktiv lentivirus koder for revers tetracyklin transactivator. I motsetning til fibroblaster, kan perifere blodceller samles via minimalt invasive prosedyrer, sterkt redusere ubehag og nød av pasienten. En enkel og effektiv protokoll for omprogrammering blodceller ved hjelp av en konstituerende enkelt excisable vektor kan akselerere bruken av IPSC teknologi ved å gjøre det tilgjengelig for et bredere forskningsmiljø. Videre omprogrammering av perifere blodceller tillater generering av iPSCs fra enkeltpersoner som hud biopsier bør unngås (ie. Avvikende arrdannelse) eller på grunn av pre-eksisterende sykdomstilstander preventing tilgang til punch biopsi.
Her viser vi en protokoll for generering av menneskelige iPSCs fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjelp av en enkelt floxed-excisable lentiviral vektor konstitutivt uttrykker de 4 faktorene. Fersk eller tint PBMC er utvidet for 9 dager som beskrevet 10,11 i medium som inneholder askorbinsyre, SCF, IGF-1, IL-3 og EPO før de transduced med STEMCCA lentivirus. Cellene blir deretter platet ut på MEFs og ESC-lignende kolonier kan visualiseres to uker etter infeksjon. Endelig er utvalgte kloner utvidet og testet for ekspresjon av de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. Denne protokollen er enkel, robust og svært konsistent, og gir en pålitelig metode for generering av humane iPSCs fra lett tilgjengelig 4 ml blod.
Vi heri beskrive bruken av STEMCCA lentiviral vektoren å generere humane iPSCs fra mononukleære celler isolert fra noen få milliliter av ferskt innsamlet perifert blod. Protokollen kan også brukes til å omprogrammere frosne PBMC (oppnådd direkte fra buffy coat), en detalj av betydelige praktiske implikasjoner når utnytte donorceller anskaffet fra et fjernt sted. Før induksjon av omprogrammering, må isolerte PBMC gjennomgå en kritisk utvidelse trinn som gjør en sunn proliferating populasjon av celler mer motta…
The authors have nothing to disclose.
Disse studiene ble finansiert delvis av NIH UO1HL107443-01-prisen til GJM og GM.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
IMDM | Invitrogen | 12440 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
SCF | R&D Systems | 255-SC | |
EPO | R&D Systems | 286-EP | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Polybrene | Sigma | H-9268 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |