Summary
短期视觉描述的手术技术和设备用于交付（基因和细胞）治疗脊髓。中的动物，但该技术被证明是完全平移和当前正用于人类应用。
Abstract
这是一个紧凑的可视描述的手术技术和装置，用于提供到脊髓（基因和细胞）疗法的组合。虽然该技术被证明在动物体内，该过程是FDA批准的，目前用于ALS患者的脊髓干细胞移植到。虽然FDA已确认疗效高度特征的啮齿动物模型中证明的原则上的数据，大型动物的使用被认为是关键的，用于验证的组合的外科手术过程中，移动设备，和供人类使用的安全性的最终治疗。的大小，解剖学和一般的脆弱性脊椎和脊椎神经的猪被确认为更好的模型的人。而且从人类的揭露和处理以及封闭伤口在猪脊髓，手术过程中几乎没有区别。我们相信，健康的猪模型是一个关键校准第一步在研究程序安全。
Protocol
1。动物用
已批准程序演示本文由埃默里大学实验动物护理和使用委员会（IACUC）。女哥廷根小型猪，体重约15-20公斤。
2。麻醉
动物约12小时，在手术前禁食。动物镇静和麻醉诱导肌注氯氨酮（35毫克/千克），乙酰丙嗪（1.1毫克/公斤），与阿托品（0.04毫克/千克）的鸡尾酒。动物的氧和1-3％的异氟醚全身麻醉气管插管和维护。在这一点上，每个动物的背部和头部被剃光。麻醉深度监测的兽医人员。缺乏叉，角膜和眼睑反射消失，以及心脏和呼吸频率，脉搏血氧饱和度，直接/间接血压，呼气末二氧化碳测量，肌张力/对有害刺激的反应是用来监测深度麻醉。
3。定位
动物被带到手术室，置于俯卧在一个框架定制设计的模仿患者定位在杰克逊脊柱外科表。帧利用可调吊索，划归的胸部和骨盆的动物，使腹部挂自由，因此，尽量减少腹部和胸部，和随之而来的的硬膜外静脉出血（ 图1）上的压力。该框架还提供了外固定脊柱的步骤1。
此外，动物被放置在温水重新循环垫，以保持身体的温度和耳缘静脉插管输液和任何手术过程中提供必要的药物。最后，外科领域prepped用酒精和Chlorhexadine或聚维酮碘溶液，手术布被放置在外科领域。
文件“> 4。椎板切除术约10-15厘米的皮肤切口和剥离椎旁肌肉组织的脊柱双边。接着，背侧多级椎板切除术进行。三椎覆C3-C5，L2-L4段的椎板和棘突咬骨钳和手术钻去除。
5。放置在脊髓德里克 -
我们称之为脊柱井架设备的设计，交付（基因和细胞）治疗脊髓2-5。此设备的设计和改进的详细讨论可以找到Riley 等人 ，2011。
为了确保移动设备以病人，经皮员额放置通过1厘米皮肤切口的上方和下方的主切口和安装在上面和下面的主切口椎板。
接着，两个集成的牵开器被连接到了聚焦回合经皮职位上方和下方的切口部位的脊柱的区域已经经历椎板切除术暴露。
6。硬脑膜开幕
与援助的的伍德森牙科工具和一个11刀片服务器，一个2.5厘米的切口通过硬脑膜，暴露脊髓。硬膜反射离开的脑膜层使用4-0 Nurolon的缝合，固定深椎旁肌肉组织。
外科手术的肉饼被放置在喙和尾部的极端开幕。这些提供了部分障碍，脑脊液流动的外科医生，不要损坏电线将吸盘还提供了一个安全的目标。在人类中，在手术显微镜下放大，软膜表面解剖在这一点上。由于技术上的限制，这个过程并不需要或可行的动物。
7。脊髓注射和侧向位移的脊髓德里克额外注资小号
紧接注射，静脉推注甲基强的松龙（125毫克，IV），以防止脊髓肿胀。
在这一点上，该平台轨道系统的连接和调整，以适应相应的长度的侧轨。 Gondola的 顶部加载到2个酒吧和Z驱动器被安装在万向接头。接着，被加载的插管放置到微硬盘。显微注射平台上使用的万向接头，冠状面和矢状面的角度进行调整，以确保脊髓的注射剂按照安置在插管的表面正交的轨迹。针定位相应的内侧背根进入区（DREZ）。 DREZ被确定在3.5倍手术放大镜的放大倍率，渗透在一个点线面垂直轨迹<1 mm的内侧。
在人类中，手术前的MRI提供了一个基线评估Øf的脊髓尺寸为手术计划。此外，测量厚度的脊髓腹侧角来确定的目标深度。
将悬浮液注入在从软膜接触的深度为4毫米。的凸缘由ULTEM塑料制成的作为软表面上的挡块，以防止针推进深度超过所需。一旦被定位在目标的针尖，刚性的金属外套筒被拉升，留下暴露的柔性管。注射完毕后，将针留在原地，一个额外的1分钟，以防止细胞回流上升插管注入道。
并小心避免表面血管的微硬盘无论是偏侧或rostro的，尾部略作调整。从普及率的网站中有一些出血现象可能会出现。当遇到这种出血，微肉饼被放置在穿刺部位出血和吸力被施加到它们以毛细血满分插管penetrATION的网站，防止积聚在电源线。这可靠地允许血液凝结。烧灼避免直接的压力。
针去除后，立体定位仪沿rostro尾椎轴迁移到下一个目标网站，由2个或4毫米或必要的，以避免可见的血管，脊髓的背侧面分开。这个过程被重复多次，在一个给定的研究提出。
8。浮动套管
使用一个自定义的输液套管的直径缩小为注射剂。所述套管包括30隔距柔性可变长度的硅橡胶管连接到固定长度的30隔距的斜口针。的前端部嵌合，其被安装到一个微量注射器泵与一个Hamilton鲁尔锁定。近端的硅橡胶管ensheathed内24隔距刚性的外套管，座椅上的注射针的近端凸缘。该法兰盘座位外套管和作为用于注射针的深度停止。为每次注射，输注的治疗的悬浮液的适当体积的由使用一个预先校准MINJ-PD的微量注射器泵（的Tritech研究公司，洛杉矶，CA）的在5微升每分钟的速率。
9。关闭
一旦所有的注射剂，轻轻地去除脊髓井架和关闭切口在四层。关闭硬脑膜使用一个4.0 Nurolon的针，水密性方式。 0薇乔缝线用于深达肌层。 0薇乔缝线也水密性方式，筋膜，然后关闭。真皮层最终收报2.0薇乔，与正在运行的线迹。皮肤缝合完成后，用3-0尼龙线。
10。恢复和疼痛管理
动物被拔除气管插管和监测麻醉后2小时恢复。接着，动物被转移到各个C年龄和用于食品消费，排便，排尿，每天至少一次监测。
疼痛管理，经皮芬太尼贴剂（75微克）装订在动物背部手术后镇痛三天。此外，也可以给予丁丙诺啡（0.05毫克/千克，BID，IM），最多至三天后可操作。
11。结果有代表性的结果
临床和行为观察手术前，然后记录在1〜7天，每周根据研究设计，直到终点。行为数据被收集评估神经系统的发病率，如先前描述的6。感觉功能的评估是通过存在或不存在的戒断反应机械刺激的前部和后肢脚趾。运动功能如下Tarlov评分（ 表1）：0 -麻痹，没有动静; 1 -能感觉到强直性后肢轻微米; 2 - ovement后肢的运动，但无法坐或站，3 - 站立和行走，但共济失调和短期内的能力; 4 - 完全恢复，运动功能正常。
被确定的程序的安全能力的动物返回到手术前的基线。瞬态的神经功能缺损应主要解决手术后1和7天之间，取决于动物的品种和程序（注射数的一些变体中，除其他的参数）。永久的发病率被定义为持久的神经功能障碍，不解决的时候，动物达到的IACUC默认端点（ 图2）。
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Representative Results
| Tarlov评分 | |
| 0 | 瘫痪，无运动 |
| 1 | 能感觉到的强直性在后肢，轻微的运动 |
| 2 | 在后肢的运动，但不能坐或站 |
| 3 | 站立和行走的能力，但共济失调，短期内 |
| 4 | 完全恢复，运动功能正常; |
表1。Tarlov评分。神经系统的发病率和恢复的得分动物的运动功能进行评估。
图1。 定位程序及表（五）动物被放置在一个框架定制设计的模仿患者定位在杰克逊脊柱外科表成俯卧位。帧利用可调吊索，划归的胸部和骨盆的动物，使腹部挂自由和，因此，最小化的腹部和胸部的压力，随之而来的硬膜外静脉出血。该框架还提供了外固定脊柱的程序。
图2。 运动功能的评估和有代表性的结果。动物进行神经系统检查，术前和定期的过程中完全恢复后一般。根据Tarlov评分步态和运动功能进行评估。这种规模提供了客观的标准，评估动物的走动作为surro运动功能栅极衡量。被确定的程序的安全能力的动物返回到手术前的基线。瞬态的神经功能缺损应主要解决手术后1和7天之间，取决于动物的品种和程序（注射数的一些变体中，除其他的参数）。永久的发病率被定义为持久的神经功能障碍，不解决的时候，动物达IACUC默认端点。
补充
在细胞疗法之前，椎板切除术和麻醉下，颈静脉10F慢性导管（接入技术，CCPS072106A）的情况下，放置用于静脉给药的免疫抑制剂的研究的持续时间。 prepped和搭着动物的脖子。颈内静脉暴露手术插管固定导管，以3-0真丝领带。颈内的近端是Ň连接以3-0真丝领带。接下来，导管隧道满分颈部皮肤背侧，用3-0尼龙线迹固定。最后，伤口灌溉和关闭正在运行的3-0尼龙线迹。在人类中，这种过程不是必需的。
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Discussion
尽管人类的7-9所描述的技术进行批准，为了脊髓治疗成功的关键问题仍有待回答。 脊髓耐受性脑实质内注射需要一个严格的理解，使开发疗法的试验性脱髓鞘性，变性，外伤性脊髓病的规划和执行。目前，还没有清晰的认识注射的数量，大型哺乳动物的脊髓可以承受的，没有暂时性和永久性的发病率。同样，注射的间隔可能是影响发病率。此外，宏观的（ 例如 ，通风相关的或无意的患者的运动）和显微镜（ 即 ，两个通风和心脏脉冲振荡）脊髓运动构成风险，在注射过程中的脊髓。在大型动物模型，将有助于了解发病的阈值所有脊髓治疗方案剂量的计算。我们的翻译脊髓移植实验室是帮助所有团队目前正在设计试验的脊髓应用的临床前开发方案。
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Disclosures
Boulis是博士发明的设备，使安全，准确的人类脊髓注射。 Neuralstem，公司已经购买了这项技术的独家授权。 Boulis的清查博士占这项费用和有权利分配这项技术的专利使用费。其他作者有没有透露。
Acknowledgments
我们感谢埃默里大学部兽医照顾动物资源的工作人员。资金来源包括：ALS协会，国防部，Neuralstem公司
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal Derrick | Neuralstem, Inc. | Neuralstem, Inc. has purchased an exclusive license to this technology | |
| MINJ-PD Microinjector pump | Tritech Research, Inc. | Customized for this specific application | |
| Floating Cannula | Neuralstem, Inc. | Custom-designed for this specific application |
References
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- Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord. Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).
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