Summary
Werkwijze voor submitochondrial vesicles verrijkt F1FO ATP synthase complexen rattenhersenen isolaat wordt beschreven. Deze vesicles kunnen de studie van de activiteit van F1FO ATPase complex en de modulatie met de techniek van patch clamp opname.
Abstract
Mitochondriën zijn betrokken bij vele belangrijke cellulaire processen, waaronder het metabolisme, overleving 1, ontwikkeling, calcium signalering 2. Twee van de belangrijkste mitochondriale functies gerelateerd aan de efficiënte productie van ATP, de energie-eenheid van de cel, door oxidatieve fosforylering en bemiddeling van signalen voor geprogrammeerde celdood 3.
Het enzym primair verantwoordelijk voor de productie van ATP is F1FO ATP-synthase, ook wel ATP synthase 4-5. De afgelopen jaren is de rol van mitochondriën in apoptotische en necrotische celdood aanzienlijke aandacht gekregen. In apoptotische celdood, BCL-2 familie eiwitten zoals Bax voer de mitochondriale buitenste membraan, oligomerize en permeabilize de buitenste membraan, het vrijgeven van pro-apoptotische factoren in het cytosol 6. In klassieke necrotische celdood, zoals die welke door ischemie of excitotoxiciteit in neuronen, eee, slecht gereguleerde toename matrix calcium bijdraagt aan de opening van de binnenste membraan poriën, de mitochondriale permeabiliteittransitieporie of MPTP. Dit depolariseert de binnenste membraan en veroorzaakt osmotische verschuivingen, bij te dragen aan buitenste membraan breuk, vrijgave van pro-apoptotische factoren, en metabole stoornissen. Veel eiwitten waaronder Bcl-xL 7 interageren met F1FO ATP synthase, modulerende zijn functie. Bcl-xL interageert direct met de beta-subeenheid van F1FO ATP synthase, en deze interactie neemt een lek geleiding binnen de F1FOATPasecomplex, het verhogen van de netto transport van H + door F1FO tijdens F1FO ATPase activiteit 8 en waardoor mitochondriale efficiëntie. Om de activiteit en de modulatie van de ATP synthase bestuderen, we geïsoleerd van knaagdierhersenen submitochondrial blaasjes (SMVS) met F1FO ATPase. De SMVS behouden de structurele en functionele integriteit van de F1FO ATPase zoals in Alavian et al.. Hier beschrijven we een werkwijzedat we met succes gebruikt voor de isolatie van SMVS uit rattenhersenen en we bakenen de patch clamp techniek kanaalactiviteit analyseren (ion lekkage geleidbaarheid) van de SMVS.
Protocol
1. Brain Mitochondriale Isolatie (Bewerking van Brown MR et al.. 9)
- Offer de rat met behulp van door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) erkende methoden.
- Snijd de kop van het dier door onthoofding, snijd de huid en bloot de schedel.
- Open de schedel zachtjes door te snijden met een schaar of rongeur. Verwijder de hersenen.
- Hak fijn de hersenen zonder cerebellum in Isolatie Buffer (zie tabel 1) en overbrengen naar een 5 ml glazen / teflon homogenisator (zie inventarislijst).
- Homogeniseren tissue zachtjes 10 keer (geen luchtbellen), ongeveer 5 minuten.
- Centrifugeer monster bij 1500 g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge.
- Sla het supernatant (mitochondriale en synaptosomen) en gooi de pellet (nucleair materiaal en celresten). Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge.
- Afdankensupernatant en resuspendeer pellet in 500 ui buffer Isolation. Verstoren synaptosomen met een celdisruptie vat (zie inventarislijst). Breng een druk van 1200 psi gedurende 10 min, gevolgd door een snelle decompressie.
- Laag van het mengsel op Ficoll gradiënten (zie tabel 2), plaats in de SW-50.1 rotor en centrifugeer bij 126.500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C in een ultracentrifuge (zie inventarislijst). De pellet is het gezuiverde mitochondria, de laag tussen de verschillende dichtheid van Ficoll is ongestoord synaptosomen.
- Was de pellet door centrifugeren in isolatie buffer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge.
2. Submitochondrial Vesicles (SMV) Isolatie (Bewerking van Chan et al.. 10)
- Resuspendeer mitochondria in 200 ul Buffer Isolatie gecombineerd met een gelijk volume van 1% digitonine en laten zitten op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg meer Isolatie Buffer en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C in een bench-top centrifuge. Doe dit twee keer.
- Resuspendeer pellet in 200 ui Isolatie buffer en voeg 2 pl van 10% Lubrol PX (C12E9). Meng en laat het zitten op ijs gedurende 15 minuten.
- Layer mengsel op Isolation Buffer, in SW-50.1 rotor en centrifugeer bij 182.000 x g bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Wassen definitieve pellet door centrifugeren in een desk-top centrifuge Isolatie buffer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
3. Elektrofysiologische opname
- Een typische elektrofysiologie rig omvat een versterker, een PC met een Digidata 1440A analoog-digitaalomzetter interface in combinatie met pClamp10.0 software, manipulatoren, een microscoop, een trillingsisolatie tafel Faraday kooi.
- Borosilicaatglas capillaire buisjes worden ingebracht in een Flaming / Brown Micropipet Puller Model P-87. Pipet-puller programma geoptimaliseerdgenereren pipetten met weerstanden tussen de 80 tot 100 MQ.
- SMVS worden in een fysiologische oplossing intracellulair (ATP wordt toegevoegd op het juiste moment tijdens de opname) (Tabel 3). Patch clamp pipetten zijn gevuld met dezelfde oplossing (geen ATP). Opnames gemaakt door vorming van een giga-ohm afdichting op SMVS bij kamertemperatuur. Vesicles gevisualiseerd door fase-contrast microscopie met een Nikon of Zeiss omgekeerde microscoop.
- De membraanpotentiaal wordt op spanningen van -100 mV tot +100 mV gedurende 10 seconden. Opnames worden gefilterd op 5 kHz met behulp van de versterker schakeling. Niveau van strooi elektrische en niet-specifieke geluid van minder dan 1 pA zijn wenselijk voor een succesvolle opname.
- Gegevens worden geanalyseerd met Clampfit 10,0 software bijvoorbeeld de frequentie en amplitude van een kanaal gebeurtenissen te bepalen. Spanningsafhankelijkheid wordt bepaald door het uitzetten van een gelijkstroomspanning relatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste stap van ons protocol maakt isolatie van gezuiverde mitochondria zoals getoond door Western blot in figuur 1. In figuur 2 wordt een voorbeeld getoond van hersenen afgeleide submitochondrial vesicle patch opname. Met behulp van de inside-out patch configuratie demonstreren we kanaal activiteit gemoduleerd door ATP. De besturing (CTL) opname (links) toont multi-geleiding channel activiteit met een piek geleidbaarheid van 600 pS gemiddeld. die onmiddellijk werd verminderd bij toevoeging van 1 mM ATP aan het bad. Het algemene effect van ATP is de geleiding van SMVS pleisters afname in een concentratie-afhankelijke wijze. Om de efficiëntie van F1FO ATPase meten na isolatie, maten we de beweging van H + ionen in de SMVS in reactie op ATP hydrolyse zoals getoond in figuur 3, het meten van de afname in fluorescentie-intensiteit van de SMV-uitgesloten H + indicator ACMA. ATP-gevoelige H + ionen beslaglegging in SMVS wordt versterkt na toevoegenvulle van ATP. Deze test kan worden gebruikt om de efficiëntie van H + ion opslag meten. Minder efficiënt zal SMVS H + ionen langzamer of een kleinere piekwaarde accumuleren. Bijvoorbeeld H + ion vastlegging wordt verminderd door de toevoeging van Bcl-xL remmers en FCCP (Alavian et al.., 2011).
| Final Concentratie | |
| Sucrose | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0.5% |
Tabel 1. Isolatie Buffer.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| Sucrose | 12 ml 1 M |
| EDTA | 18.75 gl 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 gl 1 M (pH 7,4) |
| Toplaag 7,5% Ficoll | |
| Ficoll voorraad | 10 ml |
| Isolatie Buffer | 6 ml |
| Onderste laag 10% Ficoll | |
| Ficoll voorraad | 15.5 ml |
| Isolatie Buffer | 2,5 ml |
Tabel 2. Ficoll voorraad.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabel 3. Interne Solutie.
Figuur 1. Representatieve immunoblot lysaat gezuiverd uit cytosol en mitochondriën. Het bovenste paneel toont een immunoblot met een antilichaam tegen het cytosoleiwit GAPDH. Het onderste paneel toont een immunoblot met een antilichaam tegen het mitochondriale innner membraaneiwit CoxIV.
Figuur 2. Twee representatieve patch clamp opname vóór en na toevoeging van 1 mM ATP. Houden van potentieel is 70 mV. De stippellijn vertegenwoordigt 0 pA. Elk spoor wordt geregistreerd gedurende 10 seconden en er is 10 sec tussen de sporen.
Figuur 3. Voorbeeld sporen van de fluorescentie intensiteit veranderingenACMA de indicator in de tijd in de aanwezigheid van SMVS en in de afwezigheid (zwarte sporen) en aanwezigheid (rode spoor) van ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven werkwijzen kan de isolatie van zuivere mitochondria eind van stap 1 en submitochondrial vesicles (SMVS) na stap 2 van volledige hersenen zonder onderscheid cel phenotypes.SMVspurified met deze methode in hoofdzaak vrij is van andere subcellulaire organellen zoals in Figuur 1 en onze eerdere werk (Alavian KN et al.. 8) en voorafgaand aan het bevriezen van hun structurele en functionele integriteit te behouden. Na invriezen en ontdooien, die mitochondria of SMVS worden gebruikt voor opnamen en biochemische analyses, maar niet voor respiratoir studies.
Deze werkwijze kan bovendien worden gebruikt voor het isoleren mitochondria van de lever met dezelfde stappen. Omdat de mitochondriën en SMVS neiging om clusters te vormen wanneer uitgeplaat in de elektrofysiologische opname kamer, moet aandacht worden besteed aan het laden van het monster, als een veel klitten of overmatige verdunning kunnen de mogelijkheden afnementy van de afdichting formatie. Bovendien moet aandacht worden besteed aan een aantal technische details voordat de isolatie. Het is cruciaal om schoon gereedschap te gebruiken en te houden op het ijs. Alle procedures worden uitgevoerd op ijs en alle centrifuges ingesteld op 4 ° C. Voorbereiden van de Ficoll gradiënt goed is van cruciaal belang voor een geslaagd experiment. Een perfecte scheiding tussen de twee concentraties van Ficoll verhoogt de zuiverheid van subcellulaire fracties.
Een beperking van deze techniek wordt opgelegd door de uiteindelijke hoeveelheid eiwit, die klein kan zijn als monster van een specifiek hersengebied is gewenst bijvoorbeeld mitochondriën van substantia nigra pars compacta of striatum. Pooling monsters van verschillende dieren noodzakelijk zijn de totale hoeveelheid eiwit geoogst verbeteren.
Mitochondria of SMVS worden bemonsterd bij 1 mg / ml en bewaard bij -80 ° C en die stabiel zijn opnames van enkele maanden, is het echter preferable niet opnieuw invriezen de mitochondriale monster na ontdooien. Blaasjes gezuiverd met deze werkwijze nuttig zijn voor de ATP synthase bestuderen met verschillende benaderingen zoals patch clamp opname, biochemische technieken en andere functionele studies. Met deze opstelling kan een analyse van de effecten van drugs of kleine moleculen op F1FO ATPase activiteit en structuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L.
