Summary
Un método para aislar vesículas submitochondrial enriquecidas en F1FO complejos ATP sintasa de cerebro de rata se describe. Estas vesículas permiten el estudio de la actividad de ATPasa F1FO complejo y su modulación mediante la técnica de la grabación de patch clamp.
Abstract
Las mitocondrias están implicadas en muchas funciones celulares importantes, incluyendo el metabolismo, la supervivencia a 1, el desarrollo y la señalización de calcio 2. Dos de las funciones mitocondriales más importantes están relacionados con la producción eficiente de ATP, la energía de la célula, por la fosforilación oxidativa, y la mediación de señales para la muerte celular programada 3.
La enzima principal responsable de la producción de ATP es la sintasa F1FO-ATP, también llamada ATP sintasa 4-5. En los últimos años, el papel de las mitocondrias en la muerte celular apoptótica y necrótica ha recibido una atención considerable. En la muerte celular apoptótica, Bcl-2 proteínas de la familia tales como Bax entran en la membrana mitocondrial externa, oligomerize y permeabilizan la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos en el citosol 6. En la muerte celular necrótica clásico, tal como la producida por la isquemia o la excitotoxicidad en neuronas, un largE, aumento mal regulado en calcio matriz contribuye a la apertura de un poro de la membrana interna, el poro de transición de permeabilidad mitocondrial o mPTP. Esto despolariza la membrana interna y causa cambios osmóticos, lo que contribuye a la ruptura de la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos, y la disfunción metabólica. Muchas proteínas incluyendo Bcl-xL 7 interactúan con F1FO ATP sintasa, modulando su función. Bcl-xL interactúa directamente con la subunidad beta de la ATP sintasa F1FO, y esta interacción disminuye la conductancia de una fuga dentro de la F1FOATPasecomplex, el aumento de la red de transporte de H + por F1FO durante F1FO actividad ATPasa 8 y aumentando así la eficiencia mitocondrial. Para estudiar la actividad y la modulación de la ATP sintasa, se aislaron a partir de cerebro de roedores vesículas submitocondriales (SMVS) que contienen F1FO ATPasa. Los SMVS conservan la integridad estructural y funcional de la F1FO ATPasa como se muestra en Alavian et al. Aquí se describe un métodoque hemos usado con éxito para el aislamiento de SMVS de cerebro de rata y delinear la técnica de patch clamp para analizar la actividad del canal (la conductancia de iones de fuga) de los SMVS.
Protocol
1. Cerebro mitocondrial aislamiento (Adaptado de Brown MR et al. 9)
- Sacrificar la rata utilizando métodos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC).
- Cortar la cabeza del animal por decapitación, cortar la piel y exponer el cráneo.
- Abra el cráneo suavemente cortando con unas tijeras o pinzas gubias. Retire el cerebro.
- Picar finamente el cerebro sin cerebelo en tampón de aislamiento (véase el cuadro 1) y transferirlo a un ml de vidrio / teflón homogeneizadora 5 (ver lista de equipo).
- Homogeneizar el tejido con cuidado 10 veces (sin burbujas), aproximadamente 5 min.
- Centrifugar la muestra a 1500 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa.
- Guardar el sobrenadante (mitocondrial y sinaptosomas) y desechar el sedimento (materiales nucleares y desechos celulares). Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa.
- Descartarsobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 l de tampón de aislamiento. Interrumpir sinaptosomas con un vaso ruptura celular (ver lista de equipo). Aplicar una presión de 1200 psi durante 10 min, seguido de una descompresión rápida.
- Capa de la mezcla en gradientes de Ficoll (ver Tabla 2), lugar en el SW-50.1 rotor y se centrifuga a 126500 × g durante 20 min a 4 ° C en una ultracentrífuga (ver lista de equipo). El sedimento es la mitocondria purificada, la capa entre las diferentes densidades de Ficoll es sinaptosomas ininterrumpido.
- Lavar la pella por centrifugación en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa.
2. Submitocondriales vesículas (SMV) Aislamiento (Adaptado de Chan et al. 10)
- Vuelva a suspender las mitocondrias en 200 l de tampón de aislamiento combinada con un volumen igual de 1% de digitonina y dejar reposar en hielo durante 15 min.
- Agregue más Buff Aislamientoer y se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C en una centrífuga de sobremesa. Haga esto dos veces.
- Vuelva a suspender el pellet en 200 l de tampón de aislamiento y añadir 2 l de 10% Lubrol PX (C12E9). Mezcle y deje reposar en hielo durante 15 min.
- Capa de mezcla en tampón de aislamiento, lugar en SW-50.1 rotor y se centrifuga a 182000 × g a 4 º C durante 1 hora.
- Lavar sedimento final mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa en tampón de aislamiento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C.
3. Registro electrofisiológico
- Una típica plataforma de electrofisiología incluye un amplificador, un ordenador PC equipado con una interfaz de convertidor de analógico a digital Digidata 1440A en conjunto con software de pClamp10.0, manipuladores, un microscopio, una mesa de aislamiento de vibraciones, jaula de Faraday.
- Tubos capilares de vidrio de borosilicato se insertan en un Flaming / Brown Micropipetas Extractor modelo P-87. Un programa de pipeta-extractor está optimizado paragenerar pipetas con resistencias entre 80 a 100 mW.
- SMVS se colocan en una solución fisiológica intracelular (ATP se añadió en el momento apropiado durante la grabación) (Tabla 3). Pipetas de patch clamp se llenan con la misma solución (sin ATP). Las grabaciones se realizan mediante la formación de un sello giga-ohmios en SMVS a temperatura ambiente. Las vesículas se visualizan por microscopía de contraste de fases con un microscopio invertido Nikon o Zeiss.
- El potencial de membrana se mantiene a voltajes que van desde -100 mV a + 100 mV durante períodos de 10 segundos. Las grabaciones se filtraron a 5 kHz utilizando los circuitos del amplificador. Nivel de ruido eléctrico o parásita no específica de menos de 1 pA son deseables para la grabación de éxito.
- Los datos se analizaron con el software de Clampfit 10.0, por ejemplo, para determinar la frecuencia y la amplitud de los eventos de un solo canal. La dependencia de voltaje es determinada por el trazado de una relación actual tensión.
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Representative Results
El primer paso de nuestro protocolo permite el aislamiento de mitocondrias purificadas como se muestra por Western blot en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de una grabación parche vesícula submitocondriales derivado del cerebro. Uso de la configuración de parche de dentro a fuera se demuestra la actividad del canal modulado por la ATP. El control (CTL) de grabación (izquierda) muestra la actividad del canal de múltiples conductancia con un pico de conductancia de 600 pS en promedio. que fue disminuida inmediatamente después de la adición de 1 mM de ATP para el baño. El efecto global de ATP es disminuir la conductancia de parches SMVS de una manera dependiente de la concentración. Para medir la eficiencia de F1FO ATPasa después del aislamiento, que mide el movimiento de iones H + en los SMVS en respuesta a la hidrólisis de ATP tal como se muestra en la Figura 3, la medición de la disminución de la intensidad de fluorescencia de la SMV-excluidos H + indicador ACMA. ATP-sensibles H + secuestro de iones en SMVS se mejora después de añadirition de ATP. Este ensayo se puede usar para medir la eficacia de secuestro de iones H +. SMVS menos eficientes se acumulan iones H + más lentamente o a un valor de pico más pequeño. Por ejemplo iones H + secuestro es atenuado por la adición de inhibidores de Bcl-xL y FCCP (Alavian et al., 2011).
| Concentración final | |
| La sacarosa | 250 Mm |
| Hepes | 20 Mm |
| EDTA | 1 Mm |
| BSA | 0,5% |
La Tabla 1. Tampón de aislamiento.
| Ficoll | 22 ml 20%> |
| La sacarosa | 12 ml de 1 M |
| EDTA | 18,75 l 0,1 M |
| Tris-HCl | 375 l 1 M (pH 7,4) |
| Capa superior 7,5% de Ficoll | |
| Ficoll Stock | 10 ml |
| Tampón de aislamiento | 6 ml |
| La capa inferior 10% de Ficoll | |
| Ficoll Stock | 15,5 ml |
| Tampón de aislamiento | 2,5 ml |
Tabla 2. Ficoll Stock.
| KCl | 120 mM |
| NaCl | 8 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| Hepes | 10 mM |
| pH | 7.3 |
Tabla 3. Interna Solución.
Figura 1. Representante inmunoblot de lisado purificado a partir de citosol y mitocondrias. El panel superior muestra una inmunotransferencia usando un anticuerpo contra la proteína citosólica Gapdh. El panel inferior muestra una inmunotransferencia usando un anticuerpo contra la membrana mitocondrial innner CoxIV proteína.
Figura 2. Dos patch clamp grabación representante antes y después de la adición de 1 mM ATP. Sosteniendo potencial es 70 mV. La línea discontinua representa 0 pA. Cada traza se registró durante 10 seg y 10 seg existe entre las huellas.
Figura 3. Ejemplo huellas de los cambios de intensidad de fluorescencia deel indicador de ACMA con el tiempo en presencia de SMVS y en ausencia (negro traza) y presencia (trazo rojo) de ATP.
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Discussion
Los métodos descritos en este documento permiten el aislamiento de las mitocondrias pura al final de la etapa 1 y las vesículas submitocondriales (SMVS) después de la etapa 2 a partir de todo el cerebro y sin distinción de células phenotypes.SMVspurified por este método están esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos subcelulares como se muestra en Figura 1 y nuestro trabajo anterior (Alavian KN et al. 8) y conservar su integridad estructural y funcional antes de la congelación. Después de la congelación y descongelación, aislaron mitocondrias o SMVS se utilizan para las grabaciones y ensayos bioquímicos, pero no para los estudios de las vías respiratorias.
Este método, además, se puede utilizar para aislar las mitocondrias a partir de hígado utilizando los mismos pasos. Debido a que la mitocondria y SMVS tienden a formar grupos cuando se siembran en la cámara de registro electrofisiológico, se debe prestar atención a la carga de la muestra, como una dilución excesiva aglomeración o excesiva puede disminuir la posibility de la formación del sello. Además, se debe prestar atención a varios detalles técnicos antes de iniciar el aislamiento. Es fundamental utilizar herramientas limpias y mantenerlos en hielo. Todos los procedimientos se deben realizar en hielo y todas las centrifugadoras establecen a 4 ° C. Preparación de la gradiente de Ficoll correctamente es crítico para un experimento exitoso. Creación de una perfecta separación entre las dos concentraciones de Ficoll aumenta la pureza de las fracciones subcelulares.
Una limitación de esta técnica es impuesta por la cantidad final de la proteína, que puede ser pequeña si se desea una muestra de una región específica del cerebro, por ejemplo, las mitocondrias de la sustancia negra pars compacta o cuerpo estriado. El agrupamiento de muestras de varios animales puede ser necesario aumentar la cantidad total de proteína cosechada.
Las mitocondrias o SMVS que se distribuyan a 1 mg / ml y se almacenó a -80 ° C y son estables para las grabaciones de varios meses, sin embargo, es preferable no volver a congelar la muestra mitocondrial después de la descongelación. Las vesículas purificadas por este método son útiles para estudiar la ATP sintasa, utilizando diferentes enfoques, como la grabación de patch clamp, técnicas bioquímicas y otros estudios funcionales. Con esta preparación se puede analizar los efectos de las drogas o pequeñas moléculas sobre la actividad ATPasa F1FO y estructura.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 | |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | ||
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulator | Sutter Instrument | ||
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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