<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

סיכום

שיטה לבודד את שלפוחית ​​submitochondrial מועשרת במתחמי ה-ATP synthase F1FO ממוח חולדה מתוארת. שלפוחית ​​אלה מאפשרים מחקר של הפעילות של F1FO ATPase המורכב והאפנון שלה תוך שימוש בטכניקה של הקלטת תיקון מהדק.

תקציר

המיטוכונדריה הוא מעורב בפונקציות רבות תאיות חשובות, כולל חילוף חומרים, הישרדות ^1, פיתוח ו, סידן איתות ^2. שניים מתפקידיו החשובים ביותר המיטוכונדריה קשורים לייצור יעיל של ה-ATP, מטבע האנרגיה של התא, על ידי זרחון חמצוני, והגישור של אותות למוות תאים מתוכנת ^3.

האנזים האחראי בעיקר לייצור של ה-ATP הוא synthase F1FO-ATP, המכונה גם ה-ATP synthase ^4-5. בשנים האחרונות, את תפקידו של המיטוכונדריה במוות של תאים אפופטוטיים ונימקים קיבלה תשומת לב רבה. במוות של תאים אפופטוטיים, Bcl-2 חלבונים משפחתיים כגון Bax להזין את הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, oligomerize וpermeabilize קרום החיצוני, משחררים גורמים פרו אפופטוטיים ^ל6 cytosol. במוות של תאי נמקי קלאסי, כגון זה המיוצר על ידי איסכמיה או הפעלת יתר רעילה בתאי עצב, largהדואר, גידול מוסדר היטב בסידן מטריצה ​​תורם לפתיחה נקבובית קרום פנימי, נקבובית מעבר חדירות המיטוכונדריה או MPTP. זה depolarizes הקרום הפנימי וגורם למשמרות אוסמוטי, תורם לקרע חיצוני קרום, שחרור של גורמים פרו אפופטוטיים, ובעיות בתפקוד מטבולי. חלבונים רבים, כולל Bcl-XL ⁷ אינטראקציה עם ה-ATP synthase F1FO, ויסות תפקודו. Bcl-XL אינטראקציה ישירות עם מקטע הבטא של ה-ATP synthase F1FO, ואינטראקציה זו מקטינה מוליכות דליפה בתוך F1FOATPasecomplex, הגדלת התחבורה הנקי של H + על ידי F1FO במהלך F1FO פעילות ATPase ⁸ ויעילות ובכך להגדיל המיטוכונדריה. כדי לחקור את הפעילות והאפנון של ה-ATP synthase, אנחנו מבודדים משלפוחית ​​submitochondrial מכרסם במוח (SMVs) המכיל F1FO ATPase. את SMVs לשמר את השלמות המבנית ותפקודית של ATPase F1FO כפי שמוצג בAlavian et al. כאן, אנו מתארים שיטהשאנחנו השתמשנו בהצלחה לבידודה של SMVs ממוח חולדה ואנו להתוות את טכניקת מהדק התיקון לניתוח פעילות ערוץ (מוליכות דליפת יון) של SMVs.

פרוטוקול

1. בידוד מוח מיטוכונדריאלי (מעובד מתוך בראון MR et al. ⁹⁾

1. להקריב את העכברוש תוך שימוש בשיטות שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).
2. חותכים את ראשו של בעל החיים על ידי עריפת ראש, לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת.
3. פתח את הגולגולת בעדינות על ידי חיתוך עם מספריים או rongeur. הסר את המוח.
4. ברר היטב את המוח בלי המוח הקטן במאגר הבידוד (ראה טבלת מס &#....

תוצאות

הצעד הראשון של הפרוטוקול שלנו מאפשר לבידוד של מטוהרים המיטוכונדריה, כפי שמוצג על ידי כתם מערבי באיור 1. באיור 2 מוצג דוגמה להקלטת תיקון שלפוחית ​​submitochondrial מוח נגזרת. שימוש בתצורת התיקון מבפנים החוצה אנחנו מדגימים פעילות מווסתת על ידי ערוץ ה-ATP. השליטה (CTL) הקלטה (משמאל) מראה פעילות ערוץ רבת מוליכות עם מוליכות שיא של 600 נ"ב בממוצע. שירד מייד עם תוספת של 1 מ"מ ה-ATP לאמבטיה. ההשפעה הכוללת של ה-ATP היא להפחית את המוליכות של טלאי SMVs באופן ריכוז .......

דיון

השיטות שתוארו במסמך זה יאפשר את בידודה של המיטוכונדריה טהורה בסוף השלב 1 ושלפוחית ​​submitochondrial (SMVs) אחרי שלב 2 מהמוח כולו, ללא הבחנה של תא phenotypes.SMVspurified בשיטה זו בעצם נקיה מזיהום על ידי אברונים subcellular אחרים כפי שמוצג ב איור 1 והעבודה הקודמת שלנו (Alavian KN et al. ⁸⁾ ולשמור על השלמות המבנית ותפקודית שלהם לפני ההקפאה. לאחר הקפאה והפשרה, מבודד המיטוכונדריה או SMVs משמשים להקלטות ומבחני ביוכימיים, אבל לא ללימודים בדרכי הנשימ.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דוחס רקמות Potter-Elvehjem עם עלי עם PTFE	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
צנטריפוגה Eppendorf 5424	Eppendorf	5424 000.410
כלי לפירוק תאים 4639	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
מבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט	Beckman Coulter	P20314
רוטור SW-50.1	Beckman Coulter
אולטרה-צנטריפוגה L8-70M	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
מניפולטור	Sutter Instrument
קפילרית זכוכית בורוסיליקט	World Precision Instruments	1308325
מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות Flaming/Brown דגם P-87	Sutter Instrument